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核心参数
规格: 100 test
货号: GE-20006-100
本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定,计算出初始病毒的有效滴度。产品特点►本产品采用感染病毒后靶细胞基因组作为模板,测得数据更真实►基于Taqman探针法开发本产品,结果更准确►适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定产品成分
试剂名称
内容
数量
Solution 1
标准品DNA模板(5x10^9 c/μl)
100μl
Solution 2
Lenti-primer (10μM)
40μl
Solution 3
Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM)
80μl
Solution 4
Taq (probe qPCR) (2X)
Solution 5
ROXI(50X)
Solution 6
ROX II(50X)
其他所需材料细胞基因组DNA抽提试剂(离心柱法)超纯水Q-PCR用96孔板或8连管定量PCR仪1.5ml无酶离心管用于样品制备无酶枪尖操作步骤 1.取感染72h后的293T细胞,胰酶消化制备单细胞悬液,细胞计数,得细胞数为N; 2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA,测定基因组DNA总量为G (μg),稀释至50ng/μl备用;注:此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒 3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品:
标准品管
样品管
稀释倍数
Water
标准品
拷贝数/μl
样品(50ng/μl)
10^1
45μl
5μl
5.45x10^8
10^2
5μl of 1#
5.45x10^7
10μl of #1
10^3
5μl of 2#
5.45x10^6
5μl of #1
10^4
5μl of 3#
5.45x10^5
10^5
5μl of 4#
5.45x10^4
10^6
5μl of 5#
5.45x10^3
梯度稀释取样前,需充分混匀; 4.根据下表配制反应液,每组配制3个复孔:
试剂
用量
终浓度
标准品或样本
2μl
*1
0.4μl
0.2μM
Lenti-probe (2.5μM)
0.8μl
0.1μM
10μl
1X
ROX
*2
补至20μl
*1:样本除步骤3中稀释的3种浓度外,另需一组未稀释样本,即总量为100ng/孔;另需设置阴性对照孔,即不添加任何DNA模板; *2:根据所使用仪器添加:
适用仪器
ROX I (终浓度1X)
7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System
ROX II (终浓度0.5X)
7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System
无需ROX
Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System
5.上机,按照以下程序进行Q-PCR反应: 变性 (1 Cycle):95℃ 30s 扩增 (40 cycles):95℃ 5s + 60℃ 30s 注:可根据具体使用仪器自行调整程序。 6.计算标准曲线:计算每组标准品的平均Ct值,以平均Ct值为X,Loge(copy number)为Y,生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99; 7.计算样本平均Ct值,带入标准曲线计算出copy number=n。注:以Ct值在标准曲线范围内的数据为准,若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值,需对样本稀释倍数进行相应调整。 8.计算病毒滴度:举例 Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V 其中:n=步骤7中计算所得拷贝数;d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100);G=基因组提取所得DNA总量(μg);N=基因组提取所用细胞数;Nori=病毒感染时细胞数;V=病毒感染时病毒用量(ml)。 计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度,取平均值为最终结果。
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企业名称
上海乐赛生物科技有限公司
企业信息已认证
企业类型
信用代码
91310000MA7H8C6R4D
成立日期
2022-02-22
注册资本
1000
经营范围
公司地址
苏州工业园区月亮湾路10号慧湖大厦B座 907
客服电话
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公司名称: 上海乐赛生物科技有限公司
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