Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒

本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定，计算出初始病毒的有效滴度。

产品特点
►本产品采用感染病毒后靶细胞基因组作为模板，测得数据更真实
►基于Taqman探针法开发本产品，结果更准确
►适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定

产品成分

其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂（离心柱法）
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖

操作步骤
  1.取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;
  2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；
注：此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒
  3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：

  梯度稀释取样前，需充分混匀；
  4.根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：

  *1：样本除步骤3中稀释的3种浓度外，另需一组未稀释样本，即总量为100ng/孔；另需设置阴性对照孔，即不添加任何DNA模板；
  *2：根据所使用仪器添加：

  5.上机，按照以下程序进行Q-PCR反应：
    变性 (1 Cycle)：95℃ 30s
    扩增 (40 cycles)：95℃ 5s + 60℃ 30s   
注：可根据具体使用仪器自行调整程序。
  6.计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Loge(copy number)为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99；
  7.计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。
注：以Ct值在标准曲线范围内的数据为准，若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值，需对样本稀释倍数进行相应调整。
  8.计算病毒滴度：举例
    Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
    其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；Nori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。
    计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。