莽草酸脱氢酶（SD）活性检测试剂盒 微量法

莽草酸脱氢酶（SD）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格: 100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：内含不溶物，用前摇匀。

2、 试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

3、 试剂三：临用前每瓶加入 10 mL 蒸馏水溶解。

4、 工作液的配制：根据用量按照试剂一：试剂二：试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀，备用，用前 25℃预热 15min。

产品说明：

莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。

莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH，检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液（加入前摇匀））进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

2、细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂

三、SD酶活计算

注意事项：

1. 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议2h内测完。

2. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1 mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

3. ΔA大于1时，建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（10min或15min）来测定。

4. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

实验实例：

1. 取0.1g稗草，加入1mL提取液，进行样本处理，取上清按照测得步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.2771-0.2433=0.0338，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0338，按照样本质量计算得：

SD酶活（U/g 质量）=643×ΔA÷W=217.334 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！