乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒 微量法

    乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：临用前将试剂九加入到提取液中，并于 4℃保存；

2、 试剂二：临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

3、 试剂三：临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

4、 试剂四：临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

5、 试剂五：临用前每支加入 0.5 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

6、 试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 43:457（V:V）的比例配制备用，现用现配；

7、 试剂七：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按 1:9（V:V）的比例配制备用，现用现配；

8、 试剂八：临用前加入 5 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

9、 工作液：吸取 0.06 mL 试剂二、0.2 mL 试剂三、0.13 mL 试剂四、0.04 mL 试剂五、0.04 mL 试剂六、0.04mL 试剂七、0.2 mL 试剂八混匀，也可根据比例现用现配，于冰上备用。

产品说明：

ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD⁺速率，即可反映ACK活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或细胞处理：

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英 96 孔板中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒 时的初始吸光度 A1，准确反应 3 分钟立刻 340 nm 下比色，记录 3 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2，ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2，计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

三、ACK活力计算

注意事项：

1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、 反应液的温度必须保持37℃或25℃，比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 ΔA大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；ΔA小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意计算公式变化。

实验实例：

1、 取 0.1g 肾脏组织样本，加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2=1.7666-1.0488=0.7178，ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.7178-0.0349=0.6829，按样本质量计算酶活得：

ACK（U/g 质量）=536×ΔA÷W=536×0.6829÷0.1=3660.344 U/g 质量。

2、 取 500 万大肠杆菌加入 1mL 提取液超声破碎，离心，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A测定1-A测定2=1.3965-1.3503=0.0462，ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA测定-ΔA 空白=0.0462-0.0349=0.0113，按细菌数量计算酶活得：

ACK（U/10⁴ cell）=1.072×ΔA=1.072×0.0113=0.0121136 U/10⁴ cell。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！