辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 微量法

辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂三：需要严格避光；

2、试剂六：19.2 mL 乙醇和 0.8 mL 蒸馏水混合，备用；

3、NAD 标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用；

4、NADH 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。

产品说明：

辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD，使之成为 NADH（还原型辅酶 I）。而 NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值，而 NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

混匀，取 200μL 至微量玻璃比色皿或酶标板中， 570nm 下比色，读取吸光值 ΔA=A 测定管-A 对照管，NAD标准管的记为 ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。NADH 标准管的记为 ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。（空白管只需做 1-2 次）

三、NAD+含量的计算

注意事项：

1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加，必须分开加。

2、反应过程要注意避光。

3、当吸光值大于 1 时，建议稀释后测量。

实验实例：

1、 NAD+的提取：称取约 0.1g 肌肉按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.507-0.2=0.307，ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468，按样本质量计算 NAD+ 含量得：NAD+ (nmol/g 质量）=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 质量。NADH 的提取：称取约 0.1g 肌肉按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.183-0.077=0.106，ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256，按样本质量计算 NADH 含量得：NADH(nmol/g 质量）=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 质量。

2、 NAD+的提取：称取约 0.1g 柳树叶，按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.171-0.101=0.07，ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468，按样本质量计算 NAD+ 含量得：NAD+(nmol/g 质量）=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 质量。NADH 的提取：称取约 0.1g 柳树叶，按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A对照=0.152-0.099=0.053，ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256，按样本质量计算 NADH 含量得：

NADH (nmol/g 质量）=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 质量。

3、 NAD+的提取：取 0.1mL 火鸡血清，按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.120-0.071=0.049，ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468，按液体体积计算 NAD+ 含量得：NAD+含量(nmol/mL）=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。NADH 的提取：取 0.1mL 马火鸡血清，按照提取和测定步骤操作，用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定管= A 测定-A对照=0.089-0.065=0.024，ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256，按液体体积计算 NADH 含量得：

NADH 含量(nmol/mL）=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！