禽流感血凝抑制HI实验（微量法）

禽流感血凝抑制HI实验（微量法）

抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上,干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合,抑制了流感病毒 HA凝集红细胞的能力。血凝和血凝抑制试验适用于血凝素亚型的诊断和抗体效价测定。

实验仪器与耗材

1、 96孔V型底孔板1块 ICF-PS-96V-S

2、 24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-300

3、 pH7.2、0.01 mol/L PBS溶液

4、 血清

5、 HAU抗原

6、 1%鸡红细胞悬液。

7、 200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF

8、 4道储液槽60ml 1个 RES-60-4

9、 废弃盒1个

实验步骤

第一步：

根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位(即4HAU)的病毒抗原。4HAU抗原应根据检验结果调整准确。

示例:如果血凝的终点滴度为1:256(28或8 log2)，则4 HAU =256/4=64(即1:64);取PBS 6.3 mL,加抗原0.1mL,即通过1:64稀释获得4 HAU。配制的4 HAU抗原需检查血凝价是否准确,将配制的4 HAU抗原进行系列稀释,使最终稀释度为1:2、1：3、1:4、1:5、1:6和1:7。从每一稀释度中取0.025mL,加人PBS0.025 mL,再加入1%鸡红细胞悬液 0.025mL混匀,将血凝板在室温(约20 ℃)条件下静置 40 min 或4℃ 60min,如果配制的抗原液为4 HAU,则1:4稀释度将出现凝集终点;如果高于4 HAU,可能1:5或1:6为终点:如果低于4 HAU,可能1:2或1:3为终点。

第二步：

第1孔至第11孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05 mL PBS 作为空白对照。

第三步：

第1孔加0.025 mL 血清(鸭、鹅血清在检测时建议进行预处理。)第1孔血清与PBS 充分吸取 0.025 ml 于第 2孔,依次2倍稀释至第 10 孔,从第 10 孔吸取0.025mL弃去。第11 孔作为抗原对照。

第四步：

第1孔到第11 孔均加入0.025mL 4HAU抗原，在室温 (约20 ℃)下静置 30min或4℃ 60 min.

第五步：

每孔加入0.025mL 1%（体积分数）鸡红细胞悬液(下图为模拟图片），震荡混匀,在室温(约20℃）下静置40 min 或4 ℃ 60min，空白对照孔（12孔)红组胞呈显著纽扣状时判定结果。

结果判定：当抗原对照孔(第11孔）完全凝集,且阴性对照血清抗体效价不高于1:4(22或2 log2),阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4 HAU 抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。用于检测抗体,检测鸡血清时,HI抗体效价不高于1：8(23 或3log2)判为阴性,不低于1:16(24或4 1og2)判为阳性，用于检测抗原,能够被某亚型禽流感标准血清抗体抑制,HI效价不低于1:16(24或4 1og2)时判定为该型阳性:HI抗体效价不高于1:8(23 3log2)判为阴性。对于疑似H5亚型等抗原性可能存在较大差别的病毒,应结合其他病毒检测方法进行鉴定。