移液工作站在猪瘟夹心ELISA抗原检测中的应用

猪瘟夹心ELISA抗原检测步骤

     猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。

一、实验试剂

1、包被抗体:ASFV P30蛋白单克隆抗体。

2、酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的P30蛋白单抗(针对P30蛋白的不同表位)。

3、对照:ASFV阳性对照(纯化的杆状病毒表达P30蛋白)、ASFV阴性对照(SPF猪血清)。

4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液

（配制方法：  Na2CO3  0.318g；NaHCO3  0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）

5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS )

（配制方法： pH7.4 PBS  1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）

6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS)

（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA  10 g 现配现用）

6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)

（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml  现配现用）

7、 TMD底物溶液

（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。  底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）

8、终止液(2 mol/1 硫酸)

（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加人889m去离子水中,室温分装保存）

二、仪器设备

1、酶标仪。

2、恒温孵育箱。

3、洗板机或洗涤瓶。

4、96孔酶标板。FDT-CIH-F8T

5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S

6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-300

7、4道储液槽60ml 1个 RES-60-4

8、封板膜 FDT-CP30

9、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF

三、实验步骤（图片仅为实验模拟图）

1 、用24道多功能移液工作站在所有孔中加入稀释液,25 μL/孔。

2、 酶标板上对照和待检样品的分布图,见下图。在A1、B1孔中加入阳性对照,25μL/孔;在C1、D1孔中加入阴性对照,25 μL/孔;在E1、F1等其余孔加入待检样品,25 μL/孔,37 ℃孵育60 min。

样品加样记录表

说明：
P为阳性对照

N为阴性对照

空白为待检样品孔

3、 弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔。

4、 每孔加入酶标抗体(1x),50μL/孔；37℃孵育 30 min。

5、 弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔。

6、 每孔加入底物溶液,50μL/孔,室温避光作用10min。

7、 每孔中加入50μL终止液,终止反应。

8、 用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。