本实验依据GB 31658.17-2021《动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》,使用PolyPlus HLB-2小柱在ASPE480免疫亲和固相萃取系统上运行净化方法,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行了猪肉中多兽残的检测。
结果表明,在50 μg/kg的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物,经过Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液提取,使用PolyPlus HLB-2小柱净化后,ASPE480仪器上运行净化方法多兽残的回收率均在60% ~ 110%。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备:
美正生物ASPE480免疫亲和固相萃取系统、PerkinElmer QSight液相色谱串联质谱仪。
试剂材料:
甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸为色谱纯;
乙二胺四乙酸二钠·二水、柠檬酸·一水、磷酸氢二钠·十二水、磷酸二氢钠·二水、浓氨水、氢氧化钠为分析纯;
甲醇中32种磺胺类/喹诺酮类化合物混标,P/N:MSVL0415-100M;
四环素类混合标准品,P/N:MSVL0399-100M。
0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液:取磷酸二氢钠·二水7.8 g,用水溶解并稀释至1000 mL。
0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液:取磷酸氢二钠·十二水17.9 g,用水溶解并稀释至1000 mL。
磷酸盐缓冲液:取0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液190 mL,用0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液稀释至1000 mL。
1 mol/L氢氧化钠溶液:取氢氧化钠4 g,用水溶解并稀释至100 mL。
Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液:取柠檬酸·一水12.9 g、磷酸氢二钠·十二水10.9 g、乙二胺四乙酸二钠·二水39.2 g,加水900 mL,用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至5.0 ± 0.2,用水稀释至1000 mL。
20%甲醇溶液:取甲醇20 mL,加水80 mL,混匀。
洗脱液:取甲醇150 mL,加乙酸乙酯150 mL、浓氨水6 mL,混匀。
复溶液:取水40 mL,加甲醇5 mL、乙腈5 mL、甲酸0.05 mL,混匀。
PolyPlus HLB-2小柱:200 mg/6 mL,P/N:CSS0147。
样品制备
样品提取
称取试样2 g,加Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液16 mL,涡旋1 min,超声20 min,-2℃、10000 r/min离心5 min,收集上清液。残渣中加磷酸盐缓冲液16 mL,重复提取1次,合并2次提取液,混匀,-2℃、10000 r/min离心5 min,玻璃纤维滤纸过滤,取25mL滤液,备用。
样品净化
在ASPE480仪器上,编辑运行方法进行固相萃取小柱的净化;收集洗脱液,45℃水浴氮气缓慢吹干。具体方法如下:
图1. ASPE480仪器净化方法
基质混合标准工作溶液配制
取高浓度兽药混合标准溶液,用空白样品基质溶液稀释成50 ng/mL的基质混合标准工作溶液。
色谱条件
色谱柱:Kinetex F5,2.6 µm,3.0 × 50 mm ;
流动相:A 相- 2 mM醋酸铵(含0.1%甲酸),B 相-甲醇;
柱 温:35℃;
进样量:5 µL;
梯度洗脱见下表。
液相色谱梯度洗脱条件
质谱条件
离子源:ESI+;雾化气温度:220℃;电喷雾电压:4800 V;离子源温度:300℃;反吹气温度:100℃; 质谱接口温度:250℃;采集方式:多反应监测(MRM)。
32种多兽残质谱参数
注:本实验中所有标准物质都以第一组离子对作为定量离子对。
实验结果
ASPE480仪器检测猪肉加标回收实验结果(添加水平50 μg/kg,n = 3)
实验谱图
50 ng/mL标准工作溶液色谱图
50 ng/mL猪肉基质混合标准工作溶液色谱图
猪肉基质空白色谱图
50 μg/kg猪肉基质加标色谱图
结论
本实验使用ASPE480免疫亲和固相萃取系统编辑SPE净化方法,通过PolyPlus HLB-2小柱结合LC-MS/MS的方法对添加水平为50 μg/kg的猪肉样品进行了检测。结果表明,通过使用PolyPlus HLB-2小柱结合ASPE480免疫亲和固相萃取系统对猪肉进行净化,32种兽药回收率满足要求且变异系数小于10%。
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