化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒的使用与应用！

               化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒的使用与应用！

一、背景

化学发光法生物素检测试剂盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一种通过Streptavidin-HRP及后续的BeyoECL Star试剂来实现化学发光检测Biotin标记核酸的检测试剂盒。适用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay(RPA)或EMSA等实验中，采用生物素标记的DNA或RNA探针时的检测。本试剂盒不适用于生物素标记蛋白的检测。

化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒同时还提供了封闭液、洗涤液等检测时所需的配套试剂。化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA探针或EMSA探针的制备可以相应地使用生物素3'末端DNA标记试剂盒或EMSA探针生物素标记试剂盒。

二、使用说明

1、在使用Biotin标记探针的情况下，完成Southern、Northern杂交及后续洗涤后，或RPA的转膜和交联后，或EMSA的转膜和交联后，可以使用本试剂盒开始检测。下面的检测过程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜较大或较小，各溶液的用量可以按比例放大或缩小。

2、37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。

3、取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

4、取5微升Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:3000稀释)，混匀备用。

5、去除封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

6、取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。

7、将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。

8、去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。

9、重复步骤8三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间均约为5分钟。

10、将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。

11、取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混匀，配制成ECL Reagent工作液。

12、取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。

13、在尼龙膜的表面小心加上步骤11配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。

14、取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。

15、用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。

三、应用

用于基于纳米磁分离和化学发光的肝炎分子检测新技术研究：

以肝炎为检测对象,结合化学发光和磁分离技术的优点,建立了几种快速、高通量、灵敏和实用的肝炎分子检测新技术。具体内容包括：

1、功能化磁性纳米颗粒的制备及在核酸提取中应用为提高磁性纳米颗粒功能化结合分子检测探针量,本章在进行乙肝样本高灵敏检测研究前对传统功能化磁性纳米颗粒的制备方法进行了改进,首先采用软模板法制备Fe304磁性纳米颗粒,并进行包被SiO2实验。包被前平均直径为500 nm,且为圆颗粒,大小比较均一,具有超顺磁性,饱和磁化强度为1.7374emu/g,制备的包被SiO2复合Fe3O4颗粒大小,平均粒径为700nm,制备后的Fe3O4@SiO2具有明显的核壳结构,具有较好的分散性,颗粒为圆形,大小均一。将磁性纳米颗粒应用于细菌和全血样本核酸提取中均获得良好的提取效果,有望开发出磁珠分离法核酸提取试剂盒。

2、基于功能化磁性纳米颗粒的肝炎核酸分子提取及扩增首先针对不同来源的两种乙肝核酸提取方法提取效果进行比较分析,并对提取出来的乙肝核酸样品进行验证性实验分析。结果发现,血清肝炎病毒核酸提取量虽少,但可以应用于PCR扩增,而应用于全基因组扩增效果较差。与此同时,全血中核酸提取量较高,一方面可以用于PCR扩增,还可应用于全基因组扩增技术,这样就起到了对肝炎核酸分子富集放大的作用。经过全基因组扩增的全血乙肝核酸DNA还可以进行PCR扩增。本章还对全血乙肝核酸DNA的全基因组扩增条件进行优化分析,这为今后利用化学发光的高通量多样本测定乙肝分子检测打下了基础。

3、基于纳米磁分离和化学发光的乙肝PCR扩增检测方法的建立及优化本章以生物素标记的乙肝HBV DNA为目标分子,建立了一种乙肝核酸分子的化学发光杂交检测方法,结果表明,该方法的特异性较好。通过对检测体系中涉及到的多种实验条件进行优化处理,对整个检测方法有了更深入的了解,并得出了化的实验条件,有望提高该方法的检测灵敏度。

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