人肺巨噬细胞AM的复苏与传代及冻存操作说明！

                  人肺巨噬细胞AM的复苏与传代及冻存操作说明！

细胞简介

平台编号：Bio-119748

规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

细胞信息：AM

细胞名称：人肺巨噬细胞AM

产品规格：T25培养瓶x1；1.5ml冻存管x2

细胞数量：1x10^6；1x10^6

保存温度：37℃；-198℃

运输方式：常温保温运输；干冰运输

安全等级：1

用途限制：仅供科研用途1类

培养体系：DMEM高糖培养基+10%FBS+1%双抗

培养温度：37℃

二氧化碳浓度：5%

简介：人肺巨噬细胞AM细胞取自女性供体，经过SV40永生化处理。

用途：细胞系

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1、从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。

2、从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养基并混匀。

3、操作离心 ， 调至 1000 转/分 ，时长 10 分钟

4、弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。

5、次日更换一次培养液，继续培养。

6、注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶中

细胞传代操作说明（贴壁细胞）

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1、细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。

2、按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ，消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3、注意：消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代）。

细胞传代操作说明（悬浮细胞）

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1、细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。

2、按 T25 培养瓶计，吹打均匀，吸出完全培养基，1000r/min 离心 10 min，弃上清收集细胞，铺至 2 个T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3、注意：原瓶培养基不可继续使用（传代）。

细胞冻存操作说明

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗 ，DMSO

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需冻存的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管 ，冻存管 ，记号笔

实验步骤：

1、取待冻存的细胞（按 T25 计 ）用 0.25EDTA 胰酶 2ml 消化 2min ，用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min 离心 10min ，弃上清收集细胞。 如果是悬浮生长的细胞 ，则可直接离心收集细胞。

2、加入 1ml 冻存液(90%FBS+10%DMSO )制成细胞悬液。

3、细胞悬液装入 3 支冻存管中。

4、冻存管在 4℃下存放 30 min ，转放-20℃ 1.5～2 h ，再转人-70℃ 4-12 h 后即可转移到液氮内(- 196℃) ，并登记。

验收细胞注意事项

1、收到人肺巨噬细胞AM细胞，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快联系。

2、收到人肺巨噬细胞AM细胞，如包装完好，请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题，细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来，显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况，出现此状态时，请不要打开细胞培养瓶，应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右，让细胞先稳定下，再于显微镜下观察，此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁，请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理。

3、收到人肺巨噬细胞AM细胞后，请镜下观察细胞，用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多，请离心收集细胞，接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液，使用新鲜配制的培养基，使用进口胎牛血清。刚接到细胞，若细胞不多时血清浓度可以加到15％去培养。若细胞迏到80%左右，血清浓度还是在10％。

4、收到人肺巨噬细胞AM细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养基吸出，留下5-10ML培养基继续培养：超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心3分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。

5、将培养瓶置于37℃培养箱中培养，盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里，存放于4℃冰箱，以备不时之需。

6、24小时后，细胞形态已恢复并贴满瓶壁，即可传代。（贴壁细胞）将培养瓶里的培养基倒去，加3-5ml（以能覆盖细胞生长面为准）PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化时间以具体细胞为准，一般1-3分钟，不超过5分钟。可以放入37℃培养箱消化。轻轻晃动瓶壁，见细胞脱落下来，加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后将溶液吸入离心管内离心，1000rpm/5min。弃上清，视细胞数量决定分瓶数，一般一传二，如细胞量多可一传三，有些细胞不易传得过稀，有些生长较快的细胞则可以多传几瓶，以具体细胞和经验为准。（悬浮细胞）用移液管轻轻吹打瓶壁，直接将溶液吸入离心管离心即可。

7、贴壁细胞，悬浮细胞。严格无菌操作。换液时，换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液，37℃，5%CO2培养。

特别提醒：原瓶中培养基不宜继续使用，请更换新鲜培养基培养。

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