人子宫内膜癌细胞的知识与应用及培养操作规程！

                  人子宫内膜癌细胞的知识与应用及培养操作规程！

一、背景

人子宫内膜癌细胞来源于39岁患有子宫内膜腺癌的女性，表达ER、PR。有报道称该细胞可产生促肾上腺皮质激素释放激素，胎盘碱性磷酸酶、绒膜促性腺激素。

二、人子宫内膜癌细胞复苏、传代及冻存流程参考

1、人子宫内膜癌细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）人子宫内膜癌细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的人子宫内膜癌细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的人子宫内膜癌细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到人子宫内膜癌细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬人子宫内膜癌细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察人子宫内膜癌细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、人子宫内膜癌细胞传代

1）待人子宫内膜癌细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出人子宫内膜癌细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使人子宫内膜癌细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集人子宫内膜癌细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人子宫内膜癌细胞冻存

1）按照人子宫内膜癌细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存

三、应用

人子宫内膜癌细胞可以用于姜黄素诱导人子宫内膜癌细胞（HEC-1-B）凋亡及其机制的研究：

观察姜黄素对人子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)体外增殖及相关蛋白表达情况的影响,探讨姜黄素诱导人子宫内膜癌细胞凋亡的机制。

方法：将体外养殖的HEC-1-B细胞进行随机的抽样分组,分别为对照组、姜黄素Ⅰ、姜黄素Ⅱ、姜黄素Ⅲ和姜黄素Ⅳ组共五个小组。分别给与不同浓度的姜黄素(0,10,20,40,80)μmol/L培养48h和72h。

采用MTT法：1.检测人HEC-1-B细胞生长抑制率2.Hoechest33258荧光染色观察人HEC-1-B田胞核形态的变化3.Western blot法检测相关蛋白的表达水平。用SPSS19.0统计学软件对上述检测结果做统计学分析。

结果：1、姜黄素对HEC-]-B增殖和凋亡的影响

(1)MTT实验结果显示,将所有的小组进行观察对比分析,结果发现姜黄素每个小组吸光度都比对照小组低,(P<0.01),同时发现用药组的浓度在(10～80)μmol/L区间里对剂量具有很强的依赖性,这就反映了姜黄素有阻碍HEC-1-B细胞发展的作用。

(2) Hoechest33258荧光染色观察显示,对照组细胞形态规则,而姜黄素各组细胞呈核碎裂、核固缩、荧光强度增强等凋亡特征。提示姜黄素可诱导人子宫内膜癌(HEC-1-B)细胞凋亡。

2、姜黄素对HEG-1-B细胞相关蛋白表达的影响Western blot法结果显示,与对照组比较,不同浓度的姜黄素作用48h和72h之后,和对比组进行对照,结果HEC-1-B细胞的Survivin蛋白表达在这段时间里呈现下降的趋势,它是伴随着姜黄素浓度的增加和作用时间的上升而表达减少(P<0.01),而且具有时间-剂量依赖性。Western blot检测caspase-3蛋白,与对比组进行对照,不同浓度的姜黄素作用48h和72h后,HEC-1-B细胞的caspase-3蛋白表达水平均较对照组有不同程度的升高,并随姜黄素浓度及作用的时间的增加而递增,呈时间-剂量依赖性(P<0.01)。

结论：姜黄素对体外培养的人HEC-1-B细胞具有抑制作用,且这种抑制作用在一定浓度范围内呈时间-剂量依赖方式。一定条件下,可抑制人HEC-1-B细胞生长,且诱导其凋亡,其机制可能是下调HEC-1-B细胞survivin蛋白的表达,直接激活caspase-3蛋白而诱导人HEC-1-B细胞凋亡。

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