SW1271人肺腺癌贴壁细胞系的培养操作规程！

                   SW1271人肺腺癌贴壁细胞系的培养操作规程！

一、背景

SW1271人肺腺癌贴壁细胞系是一种来源于人肺腺癌的贴壁细胞系。它是一种体外培养的肿瘤细胞系，可用于研究肺癌的发生、发展和治疗。

SW1271人肺腺癌贴壁细胞系的特点是具有高度的贴壁生长能力，能够在培养皿中形成紧密的单层细胞。此外，它还具有多药耐药性，即对多种化疗药物具有抵抗力。因此，SW1271细胞系在肺癌研究中具有重要的应用价值。

二、SW1271人肺腺癌贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏SW1271人肺腺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)SW1271人肺腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)SW1271人肺腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

SW1271人肺腺癌贴壁细胞系可以用于硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究：

检测了人肺腺癌组织和相邻癌旁组织中内源性硫化氢合成酶的表达情况。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blot实验结果显示,30对肺腺癌组织临床样本中3种硫化氢合成酶CBS、CSE和MPST的表达量显著高于癌旁组织。其中,CBS和CSE的表达水平与肺腺癌肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移程度有明显相关性,而MPST的表达水平主要与肿瘤大小有关。体外结果同样表明,SW1271人肺腺癌贴壁细胞系、肺腺癌A549、95D和NCI-H1395细胞中硫化氢合成酶以及H2S含量明显高于正常肺上皮BEAS-2B细胞。

本文选择H2S含量最多的A549细胞系和SW1271人肺腺癌贴壁细胞系进行后续实验。其次,以硫氢化钠(NaHS)作为H2S供体,通过MTT实验检测NaHS对A549细胞的作用。实验结果表明,低浓度的外源NaHS(0-50μM)可促进A549细胞增殖,而2000μM浓度的NaHS则显著促进A549细胞凋亡。选取与H2S在体内含量近似的50μM NaHS作为实验浓度刺激A549细胞24小时。

结果显示,该浓度可显著促进A549细胞增殖、迁移和侵袭,加快肿瘤上皮间质转化(EMT)过程。采用化学抑制剂和小干扰RNA(siRNA)基因沉默手段分别对肺腺癌中主要产生H2S的CBS和CSE进行抑制。结果表明,化学抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)都能显著抑制细胞增殖,并将细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡;同时抑制细胞划痕愈合、transwell侵袭及EMT过程。上述结果在siRNA基因沉默实验中得到进一步验证。

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