CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

                    CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

一、背景

CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系是一种来源于人舌鳞癌组织的贴壁细胞系。这种细胞系在培养过程中能够保持其生物学特性，并可用于研究人舌鳞癌的发生、发展、治疗和药物筛选等方面的实验。

CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系的保存条件通常为低温避光，并且需要在高纯度的条件下进行培养。这种细胞系具有一定的异质性，可以作为研究其他肿瘤细胞的模型之一。

二、CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系可以用于辛伐他汀通过钙激活氯通道TMEM16A抑制口腔鳞状细胞癌增殖的机制研究：

通过一系列的实验验证TMEM16A在口腔鳞癌中的表达和临床意义,研究TMEM16A对口腔鳞癌细胞增殖的影响,以及辛伐他汀对口腔鳞癌细胞增殖的影响及其作用机制。

研究方法：通过对TCGA数据库中305例口腔鳞癌标本和30例癌旁组织标本的临床数据和TMEM16A m RNA表达数据进行生物信息学分析,对GEO数据库中40对口腔鳞癌标本和癌旁组织标本的TMEM16A m RNA表达数据进行生物信息学分析。对84例口腔鳞癌组织切片及12例正常口腔黏膜组织切片的免疫组织化学染色分析并结合患者的临床资料,来研究TMEM16A在口腔鳞癌组织与非癌组织中的表达差异及其与口腔鳞癌患者各项临床指标的关系。

通过全细胞膜片钳技术验证TMEM16A在CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系中是否介导钙激活氯电流。通过CCK-8实验分别研究敲低TMEM16A、TMEM16A抑制剂、过表达TMEM16A对口腔鳞癌细胞增殖的影响。通过全细胞膜片钳技术研究不同浓度的辛伐他汀对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系中TMEM16A通道功能的影响。通过Western blot实验研究辛伐他汀对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞中TMEM16A蛋白表达量的影响。通过CCK-8实验研究辛伐他汀对口腔鳞癌细胞CAL-27、CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系和人永生化表皮细胞Ha Ca T细胞增殖的影响。

通过CCK-8实验研究不同浓度的辛伐他汀对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞增殖的影响以及加入过量MVA、敲低TMEM16A或过表达TMEM16A对辛伐他汀增殖抑制作用的影响。结果:数据库生物信息学分析结果表明,口腔鳞癌组织中TMEM16A m RNA的表达量显著高于癌旁组织。TMEM16A m RNA的表达量与口腔鳞癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期显著相关。T3与T4分期、N1-N3分期、临床分期Ⅲ期及Ⅳ期的口腔鳞癌患者中TMEM16A m RNA的表达量分别高于T1与T2分期、N0分期、临床分期Ⅰ期及Ⅱ期的口腔鳞癌患者。Kaplan-Meier生存分析结果表明,TMEM16A m RNA高表达的口腔鳞癌患者的总生存时间显著低于TMEM16A m RNA低表达的患者。

免疫组织化学染色结果表明,口腔鳞癌组织中TMEM16A蛋白的表达量显著高于正常口腔黏膜组织。TMEM16A蛋白的表达量与口腔鳞癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期显著相关。T3与T4分期、N1-N3分期、临床分期Ⅲ期及Ⅳ期的口腔鳞癌患者中TMEM16A蛋白的表达量分别高于T1与T2分期、N0分期、临床分期Ⅰ期及Ⅱ期的口腔鳞癌患者。Kaplan-Meier生存分析结果表明,TMEM16A蛋白高表达的口腔鳞癌患者的总生存时间显著低于TMEM16A蛋白低表达的患者。TMEM16A在CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系中介导钙激活氯电流。TMEM16A的敲低、TMEM16A的抑制剂T16Ainh-A01(20μM)可以显著抑制CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞的增殖。TMEM16A过表达可以显著促进口腔鳞癌细胞CAL-27的增殖。

辛伐他汀可以显著抑制CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞中的钙激活氯电流,且抑制效果呈现剂量依赖性。辛伐他汀的IC50为5.605±1.512μM。此外,辛伐他汀(10μM)对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞中TMEM16A的蛋白表达水平没有显著的影响。辛伐他汀(10μM)可以显著的抑制口腔鳞癌细胞CAL-27和CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系的细胞增殖,对Ha Ca T细胞的增殖没有显著的影响。辛伐他汀(10μM)对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖性。加入过量的MVA(500μM)可以显著减少辛伐他汀对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞的增殖抑制作用。TMEM16A的敲低可以显著减少辛伐他汀对CAL-33人舌磷癌贴壁细胞系细胞的增殖抑制作用。TMEM16A过表达可以显著的提高辛伐他汀对CAL-27细胞的增殖抑制作用。

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