人黑色素瘤细胞系M14的培养操作步骤及应用研究！

                人黑色素瘤细胞系M14的培养操作步骤及应用研究！

一、产品信息

平台编号：Bio-73228

规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

细胞信息：M14

细胞名称：人黑色素瘤细胞系M14

产品规格：T25培养瓶x1;1.5ml冻存管x2

细胞数量：1x10^6;1x10^6

保存温度：37℃;-198℃

运输方式：常温保温运输；干冰运输

安全等级：1

用途限制：仅供科研2类

培养体系：90%DMEM+10%FBS+1%三抗

培养温度：37℃

二氧化碳浓度：5%

简介：人黑色素瘤细胞系M14取自33岁男性供体。贴壁培养。

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、知识背景

人黑色素瘤细胞株源自一位54岁女性，是由D·J·Giard等人建立的一系列细胞株中的一株。A-375细胞在抗胸腺细胞球蛋白、血清处理的NIH瑞士小鼠中形成类似于恶性黑素瘤的快速增长的皮下肿瘤；A-375在普通成纤维细胞和琼脂上形成克隆。

三、人黑色素瘤细胞株细胞培养步骤

1、人黑色素瘤细胞株培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM基础培养基87%，

优质胎牛血清10%

GlutaMAX-1谷氨酰胺1%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠1%

P/S青霉素-链霉素1%

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、人黑色素瘤细胞株细胞处理：

1）复苏人黑色素瘤细胞株细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人黑色素瘤细胞株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人黑色素瘤细胞株细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人黑色素瘤细胞株细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1、人黑色素瘤细胞株细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

人黑色素瘤细胞株可以用于EGCG和ECG基于PI3K/AKT/mTOR通路调节人黑色素瘤细胞的凋亡和自噬：

以4种儿茶素,表没食子儿茶素3没食子酸(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)、表儿茶素3没食子酸(Epicatechin-3-Gallate,ECG)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素(Epicatechin,EC)为研究对象,结合恶性黑色素瘤模型,系统评估其通过凋亡和自噬机制调节黑色素瘤细胞增殖的具体机制,为儿茶素治疗黑色素瘤提供实验依据和理论支持。

主要研究内容如下：

(1)不同儿茶素对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用。结果显示,4种儿茶素(EGCG、ECG、EGC、EC)里只有EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞的增殖表现出明显的抑制作用,且呈现出时间和剂量依赖性。

(2)EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞凋亡的作用。流式细胞仪实验结果表明,与对照组相比,细胞经过EGCG和ECG处理后凋亡比例增加。EGCG,ECG可诱导A375细胞周期阻滞在G0/G1期;同时,EGCG也可将A375细胞周期阻滞在S期,ECG也可将A375细胞周期阻滞在G2/M期。线粒体膜电位实验表明,EGCG和ECG处理降低细胞内线粒体膜电位。Western blotting实验结果表明,EGCG和ECG处理细胞后,抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2基因(B Cell Lymphoma-2 Gene,Bcl-2)表达水平下调,促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase,Caspase-3)的表达水平上调,促进细胞凋亡。

(3)EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞自噬的作用。RT-PCR和Western blotting实验结果表明,在基因和蛋白水平上,EGCG和ECG降低沉默信息调节因子3(Sirtuin3,Sirt3)和两个自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated Protein1-Light Chain 3,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和自噬效应蛋白-1(Beclin-1)的表达水平。此外,Western blotting实验检测得到,EGCG和ECG通过抑制腺苷酸激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Adenine Monophosphate-activated Protein Kinase/Mammalian Target of Rapamycin,AMPK/mTOR)和升高磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-Kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)通路相关蛋白的表达,从而发挥凋亡和自噬调节作用。

(4)加入自噬激活剂雷帕霉素检测凋亡和自噬两者的关系。结果显示,与对照组相比,加入自噬激活剂雷帕霉素后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高,Caspase-3水平升高,Bcl-2水平下降,雷帕霉素诱导A375细胞发生凋亡和升高自噬。与单独使用EGCG和ECG处理后相比,EGCG,ECG和雷帕霉素共处理后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达依旧显著增加,但细胞凋亡的趋势并没有改变。说明对于人黑色素瘤A375细胞,细胞凋亡和自噬两者是相互独立的关系。

(5)EGCG对裸鼠恶性黑色素瘤的抑制作用。裸鼠腋下注射人源黑色素瘤细胞构建异种黑色素瘤模型,在动物水平上评估EGCG通过凋亡和自噬对黑色素瘤的作用。实验结果表明,与对照组相比,EGCG能够抑制肿瘤体积的增大,上调总的Caspase-3以及或活化型Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达,诱导肿瘤组织凋亡;EGCG下调Beclin-1和LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平,从而下调肿瘤组织内自噬水平。

综上所述,儿茶素EGCG和ECG能够抑制黑色素瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞自噬水平,对黑色素瘤具有一定的治疗作用。

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