NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系的应用！

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一、背景

NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。NK-92MI细胞是转染得到的源自NK-92细胞的IL-2非依赖的NK细胞株，亲本细胞NK-92通过微粒体基因转化法用逆转录病毒MFG-hIL-2载体携带的人IL-2cDNA进行转化，可能由于载体整合到基因组DNA中，转化是稳定的。NK-92MI细胞细胞对很多恶性细胞有细胞毒性；铬释放试验显示它能杀死K562细胞和Daudi细胞。

NK-92细胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面标记阳性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面标记阴性。NK-92MI细胞和NK-92CI细胞这两个变种都包含、表达并合成hIL-2cDNA。NK-92MI细胞合成的IL-2水平比NK-92CI高，而亲本细胞不合成表达。1998年9月提交到ATCC的培养物污染了支原体，其后代通过BM细胞周期蛋白处理21天消除支原体，处理后6周，用Hoechst染色、PCR和标准培养测试进行支原体检测，结果都呈阴性。

该细胞系的研究对于了解恶性非霍奇金淋巴瘤的发病机制、诊断和治疗具有重要意义。研究人员可以通过观察该细胞系的生长特性、增殖能力、杀伤活性等指标，探究其在肿瘤发生和发展过程中的作用。此外，该细胞系还可以用于制备疫苗、抗体等生物制品，为临床治疗提供新的思路和方法。

二、NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系复苏、传代、冻存操作

（一）NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系细胞复苏

①新制100mm平皿1个，含12mL上述培养液；

②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1~2min,待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；

③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；

④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2-4天长满。

注意：建议复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩，避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸造成人员伤害。

（二）NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系细胞传代

将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入2mL（/100mm皿/T25瓶）胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA），在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，吸除大部分胰酶，留约0.5mL，移至培养箱消化，约1min取出。传代用6mL培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可1:2传代。

（三）NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系细胞冻存

冻存则用3mL冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为3支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

三、应用

NK-92MI人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞系可以用于神经肽P物质对NK-92MI细胞迁移及趋化因子受体表达的影响：

通过检测SP对NK92-MI细胞迁移能力和细胞表面趋化因子受体表达的影响,探讨SP对NK细胞的迁移活性的直接或间接调控作用;并通过测定SP对NK92-MI细胞上CCR7、CXCR3和CXCR4表达水平的影响,以及SP受体NK-1R在SP调控NK92-MI细胞迁移活性中的作用,进一步讨论SP调控NK细胞迁移活性的机制。

研究方法：

(1)Transwell法检测不同浓度的SP(10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L)对NK92-MI细胞迁移能力的影响以及不同浓度SP对趋化因子CCL21(CCR7配体)和CXCL12(CXCR4配体)对NK92-MI细胞趋化作用的影响。

(2)Real-time PCR检测不同浓度的SP(10-12 mol/L10-6 mol/L)对NK92-MI细胞趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表达水平的影响。

(3)流式细胞术检测不同浓度的SP(10-12 mol/L10-6 mol/L)对NK92-MI细胞趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4膜表达的调控。(4)NK-1R拮抗剂作用NK92-MI细胞后,再用Transwell法测定不同浓度SP及趋化因子CCL21和CXCL12对NK92-MI细胞的趋化作用;Real-time PCR测定趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表达水平的变化。

结果：

(1)SP对NK92-MI细胞的直接趋化作用,在10-12 mol/L10-10 mol/L浓度范围内,随SP浓度增高,NK92-MI细胞的迁移力也逐渐增强,10-10 mol/L浓度SP的促迁移作用最强;其后,SP浓度继续增高,其促迁移作用反而逐渐减弱。不同浓度SP同样可以增强趋化因子CXCL12和CCL21对NK92-MI细胞的趋化作用,在低浓度范围(10-12 mol/L10-10 mol/L)SP作用下,NK92-MI细胞迁移力逐渐增加,而随着SP浓度继续增高(10-8 mol/L10-6 mol/L),NK92-MI细胞迁移力又有所减弱。

(2)SP可明显增加趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表达。10-12mol/L10-6 mol/L浓度范围的SP作用NK92-MI细胞6h,CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表达均明显增高;仅在10-12 mol/L浓度组,CXCR4的m RNA表达增高不明显,与对照组相比无统计学意义。SP作用NK92-MI细胞12h,各浓度(10-12mol/L10-6 mol/L)SP仍能显著促进CXCR3和CXCR4的m RNA表达,而CCR7的m RNA表达水平无明显增高。

(3)10-12 mol/L10-6 mol/L浓度范围的SP对趋化因子受体CCR7、CXCR3和CXCR4的膜表达作用各不相同,其中CCR7的表达具有随着SP浓度的增高而增加的趋势,在10-8 mol/L和10-6 mol/L浓度组CCR7的表达有显著增加(P<0.05);经各浓度SP作用后,CXCR3的表达水平与对照组相比有所增加,但无统计学差异;而CXCR4表达则随SP浓度的增高,具有先增高后回降的趋势,10-10 mol/L和10-8 mol/L浓度的SP对CXCR4表达有明显的促进作用(P<0.01、P<0.05)。SP对三种趋化因子受体表达的作用趋势与SP促进NK92-MI细胞迁移能力的作用趋势不完全一致,提示存在有各趋化因子受体的竞争表达,或可能还有其他趋化因子受体在协同发挥作用。

(4)经NK-1R拮抗剂处理后,SP、CCL21和CXCL12均不能明显增加NK92-MI细胞的迁移活性,且各浓度SP对CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA的表达无明显促进作用,说明NK-1R拮抗剂发挥了阻断作用,提示NK-1R是SP调控NK细胞迁移活性发挥作用的途径。

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