大鼠胚胎心肌细胞的应用及培养操作步骤！

                  大鼠胚胎心肌细胞的应用及培养操作步骤！

一、背景

大鼠胚胎心肌细胞是一株由Kimes·B和Brandt·B从BD1X大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆得到的细胞株；H9c2(2-1)细胞表现出许多骨骼肌的特性。H9c2(2-1)细胞中的成肌细胞能融合形成多核的肌管，并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%，H9c2(2-1)细胞融合发生得很快。

二、细胞培养操作步骤

1、大鼠胚胎心肌细胞培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）大鼠胚胎心肌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）大鼠胚胎心肌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、大鼠胚胎心肌细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）大鼠胚胎心肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）大鼠胚胎心肌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

三、应用

大鼠胚胎心肌细胞可以用于miRNA-193a-3p对大鼠胚胎心肌细胞H9C2增殖和凋亡功能的影响：

胚胎心脏发育和先心病的发生受多种遗传因素共同调节,TBX1(T-box factor1)基因、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路都已被证实是其中较为重要的环节。

前期研究发现,TBX1基因表达下调对TGF-β2及其通路的靶向调控可能是通过下调miR-193a-3p的表达实现的,但这条通路如何实现细胞水平的调控、对细胞功能有何影响目前仍不明确。鉴于许多miRNA对相关生物学活动的调控都依赖于对细胞的增殖或凋亡的调节,本研究将从miR-193a-3p对大鼠胚胎心肌细胞H9C2增殖和凋亡的影响入手,推断其参与心脏发育和先天性心脏病发病的可能作用机制。

方法：

(1)将miR-193a-3p mimics,miR-193a-3p inhibitor分别转染至大鼠胚胎心肌细胞H9C2,qRT-PCR检测转染效率。

(2)以CCK-8法分别检测miR-193a-3p过表达和表达减低后细胞增殖能力的变化。

(3)流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测转染48h后心肌细胞的凋亡水平。

(4)实验数据使用SPSS19.0软件分析(计量数据以均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义)。

结果：

(1)与NC组相比,miR-193a-3p过表达后H9C2细胞的增殖受到抑制(P<0.01),而miR-193a-3p表达减低后心肌细胞的增殖活性增加(P<0.05)。

(2)与NC组相比,转染miR-193a-3p mimics 48h后H9C2细胞的凋亡率增高(P<0.05),而转染miR-193a-3p inhibitor 48h后心肌细胞的凋亡率减低(P<0.05),上述二者的改变均以早期凋亡为主。

结论：miR-193a-3p能够负向调节大鼠胚胎心肌细胞H9C2的增殖,正向调控其凋亡,其中对凋亡的调控环节可能位于凋亡早期;miR-193a-3p可能通过抑制心肌细胞的增殖、促进其凋亡参与心脏发育和先天性心脏病的发生。

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