小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)完全培养基的应用！

                  小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)完全培养基的应用！

一、背景

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)完全培养基(无说明书)用于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代培养及传代培养。

实验方法原理：将小鼠的成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

二、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）原代培养步骤

1、用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。

2、加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟

3、取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化。

4、离心1000转，5分钟。

5、弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次。

6、分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。

7、置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。

8、待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代。

9、吸弃培养液上清。

10、PBS（不含钙镁）冲洗两次。

11、加0.25%胰酶-0.02EDT消化。

12、在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次。

13、即刻加MEF培养液终止消化。

14、1000转，5分钟离心。吸弃上清。

15、加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代。

16、原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失。

17、原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时，杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型。

三、应用

用于Ptpn11E76K激活突变协同miR-100失活促进小鼠胚胎成纤维细胞的恶性转化研究：

用小鼠胚胎成纤维细胞研究Ptpn11编码的SHP-2蛋白激活突变调控肿瘤发生的分子生物学机制,并寻找改善患者预后的新型靶向肿瘤标志物。SHP-2是一种普遍存在的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）,该PTP包括两个串联Src同源结构域（N-SH2和C-SH2）,它们起磷酸酪氨酸结合域的作用,并介导该PTP与底物相互作用,在多种信号转导途径中发挥着至关重要的作用。SHP-2的功能失调能够诱发Noonan综合征、白血病、肺癌等。

前期研究发现,SHP-2激活突变不仅增强细胞扩散及血管生成,而且能够调节肿瘤发展中起重要作用的RAS-RAF等信号异常活化;还发现其突变增加了小鼠结直肠癌的发生。micro RNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA（约22个核苷酸）,它与其靶基因3’-UTR区结合,降解靶mRNA或抑制其翻译,参与基因转录后调控,从而在许多人类癌症中异常表达并发挥作用。我们前期在砷诱导的SHP-2 D61G功能性突变的小鼠胚胎成纤维细胞中做基因芯片检测多种miRNA表达谱发现miR-100的表达显著下降。研究发现miR-100参与调控多种细胞过程,在许多恶性肿瘤中异常表达并发挥作用。

方法：

1、取13.5d不同基因型的孕鼠制备原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）,通过相应胚胎组织的基因型鉴定后得到所需的MEFs并且纯化。

2、用表达Cre重组酶的腺病毒（Ad-Cre-GFP）同时感染制备的四组MEF细胞。在Cre重组酶作用下,能够将E76K前面的neo基因盒子敲除,从而表达E76K;并且Cre重组酶还可以利用识别loxp位点切除miR-100,实现miR-100功能失活。因此得到Ptpn11E76K突变和miR-100失活的MEF细胞株,进一步通过荧光定量PCR检测各组细胞中Cre,SHP-2,miR-100的表达情况来验证转染效率。

3、衰老相关β-半乳糖苷酶染色和相关细胞行为学实验检测Ptpn11E76K激活突变和miR-100失活对MEF细胞的生物学行为的影响:a.增殖实验:MTT,Ki67的免疫荧光和流氏细胞术,细胞周期分析b.细胞集落生长能力:平板克隆c.细胞非锚定生长情况:软琼脂集落形成d.迁移和侵袭能力:Transwell实验,划痕实验；

4、体内实验,建立裸鼠移植瘤模型检测四组MEF细胞在裸鼠体内增殖情况并将移植瘤接种在C57/BL6小鼠皮下进行传代培养。

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