SV40T转化人脐静脉内皮细胞的使用与实验方法！

                 SV40T转化人脐静脉内皮细胞的使用与实验方法！

一、细胞简介

HUVEC-T1是SV40T转化人脐静脉内皮细胞，它具有人体内皮细胞的生物学特性，是心血管研究的可靠模型，可以用于心血管疾病的发病机制、新的治疗方法，以及新型预防措施的研究。形态呈现为典型的鹅卵石样排列，已证明在体外可传至40代。HUVEC-T1内皮标记vWF、CD31、CD34均阳性，可结合凝集素，电镜下可见紧密连接和W-P小体，Matrigle上可形成管型。不同代数的HUVEC-T1细胞核型正常稳定（P12、P13、P19、P38），裸鼠体内接种不成瘤（P9和P33）。

二、产品信息

平台编号：Bio-108932

规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

细胞信息：PUMC-HUVEC-T1

细胞名称：PUMC-HUVEC-T1（SV40T转化人脐静脉内皮细胞）

种属：人

生长特性：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

背景描述：PUMC-HUVEC-T1形态呈现为典型的鹅卵石样排列，已证明在体外可传至40代。PUMC-HUVEC-T1内皮标记vWF、CD31、CD34均阳性，可结合凝集素，电镜下可见紧密连接和W-P小体，Matrigle上可形成管型。不同代数的HUVEC-T1细胞核型正常稳定（P12、P13、P19、P38），裸鼠体内接种不成瘤（P9和P33）。

生长培养基：DMEM＋0.01mg/mL Insulin＋1% NEAA+10% FBS(164210)＋1% P/S

推荐换液频率：2~3次/周

冻存条件：冻存液：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO温度：液氮

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

用途：(STR鉴定正确)

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

三、使用方法

1、悬浮细胞,2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞,要用不含EDTA的胰酶消化细胞,胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎,造成假阳性,过短,细胞黏连影响检测)*是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶消化液,加入细胞培养液终止消化,2000rpm离心5min收集细胞。

2、4℃预冷PBS,洗涤细胞2次(2000rpm x 5min),收集细胞2~5×105 。

3、离心弃上清,加入500μL结合缓冲液,轻轻吹打重悬细胞。

4、加入5μL Annexin V-FITC,轻轻吹打混匀,加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。(PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,时间允许,可以在检测前5分钟加入PI)

5、流式细胞仪检测或荧光显微镜观察。*在1h内检测。

四、实验报告

（一）分离与培养：

1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,*将组织剪成1mm3左右大小;

2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;

3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;

5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;

（二）免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;

2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;

3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;

5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h;

6、用PBS冲洗3次,每次10min,*在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

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