兔支气管上皮细胞的应用研究及培养操作步骤！

                     兔支气管上皮细胞的应用研究及培养操作步骤！

一、背景

兔支气管上皮细胞采用链霉蛋白酶-中性蛋白酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

兔气管上皮细胞分离自气管组织；气管(Trachea)，呼吸器官的一部分；为后壁略平的圆筒型管状。上端平第六颈椎下缘，与环状软骨相连；向下至第四、五胸椎体(相当胸骨角平面)交界处，分左、右主支气管，分叉处称为气管杈。

气管主要由14-16个半环状软骨构成，有弹性，软骨为“C”字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接，保持了持续张开状态。管腔衬以粘膜，表面覆盖纤毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒，纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出，以净化吸入的气体。

气管上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放多种炎性介质和细胞因子从而参与气道炎症及免疫反应。体外培养的原代气管上皮细胞因与体内组织在形态结构和功能活动上存在很大的相似性，因此，在基础及临床研究中极为重要。

二、兔支气管上皮细胞培养步骤

1、兔支气管上皮细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

2、兔支气管上皮细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）兔支气管上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

兔支气管上皮细胞可以用于兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及某些生物学特性研究：

从Bb的分离和鉴定、菌相免疫学和粘附特性四个方面进行了系统的研究。

结果如下：

1、兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定：通过对江苏南京地区4家实验兔场和山东淄博1家商品兔场有鼻炎症状的患兔鼻腔分泌物进行兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定，了解支气管败血波氏杆菌在兔群中的感染情况，并对该菌的某些生物学特性进行研究。共采集有明显鼻炎症状的194份患兔鼻腔分泌物，分离出56株支气管败血波氏杆菌，分离率为17.87％～39.39％，平均分离率28.86％，结果显示支气管败血波氏杆菌是引起家兔鼻炎的重要病原菌，分离率较高，该病的发生与季节具有一定的相关性，分离菌具有特定的生长特性、形态特性、生化反应特性和对抗生素的敏感特性。

2、支气管败血波氏杆菌人工感染动物模型的建立：对鉴定后的19株支气管败血波氏杆菌进行了ICR小鼠毒性比较研究，并以此为基础进行了分离菌对兔致病性差异研究；用BJL0504菌株(Ⅰ相菌)以不同攻毒途径对30～40日龄兔进行致病作用比较研究；用冻干保存的3株强毒力菌株以静脉注射途径攻毒家兔，根据致病性筛选毒力稳定的菌株作为疫苗候选株。ICR小鼠毒性试验表明，19株分离菌中11株为超强毒，3株为强毒，3株低毒，2株弱毒，分离菌中BJL0504对小鼠和兔均为高致病性，但BALM0503对小鼠为低致病性，对兔为高致病性，其他分离菌对小鼠和兔的致病性也不完全相同；通过肺内和静脉注射感染的兔死亡率较高，发病症状和剖检症状也比滴鼻感染明显；冻干保存15个月后BJL0504分离菌对兔依然有较高致病性，其他两株冻干菌致病性也没有变化，BJL0504分离菌可以作为疫苗候选株。

3、支气管败血波氏杆菌不同相小鼠免疫保护试验：为了研究不同相的支气管败血波氏杆菌的免疫保护情况，首先对分离菌的培养特性与相变特点以及不同相的致病性进行了研究，接着对该菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌进行灭活并免疫ICR小鼠，观察免疫产生期和攻毒保护效果。试验表明，Bb-F1～F6代菌动力试验阳性，F7～F12代菌则为阴性，其余生化试验结果F1～F12代菌完全相同；根据细菌溶血情况确定F1和F9分别为Ⅰ相菌和Ⅲ相菌。小鼠攻毒保护试验表明，经Bb-Ⅰ相菌和Ⅲ相菌灭活苗免疫小鼠后，均能产生完全攻毒保护作用。

4、支气管败血波氏杆菌粘附特性研究：用HEP-2细胞(人喉上皮细胞癌细胞系)作为体外模型，比较研究了支气管败血波氏杆菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌的体外粘附特性和粘附动力学。结果表明，强毒力分离菌BJL0504菌株Ⅰ相菌在体外可以粘附HEP-2细胞，而其传代Ⅲ相菌在体外不能粘附该细胞，与该菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌的致病性具有相关性。粘附动力学试验显示随着作用时间的延长，Bb-Ⅰ相菌在体外粘附HEP-2细胞的数目也随之增加，并在165 min时达到高峰。

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