嗜冷黄杆菌PCR试剂盒的知识与应用及相关研究！

                   嗜冷黄杆菌PCR试剂盒的知识与应用及相关研究！

一、背景

嗜冷黄杆菌PCR试剂盒是一种常用的分子生物学工具，它可以帮助科研人员快速、准确地检测和鉴定嗜冷黄杆菌。

通过使用针对嗜冷黄杆菌的PCR试剂盒，研究人员可以特异性地扩增嗜冷黄杆菌的DNA片段，从而实现对该物种的准确检测。这种检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可以检测出痕量嗜冷黄杆菌的存在，同时避免其他微生物的干扰。

二、嗜冷黄杆菌PCR试剂盒操作步骤

（一）稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3、在7号管中加入5μL阳性对照（浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

（二）样品DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

（三）设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第4号做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：

（四）数据处理

11、如果把嗜冷黄杆菌PCR试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

12、如果把嗜冷黄杆菌PCR试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性

三、应用

嗜冷黄杆菌PCR试剂盒可以用于虹鳟源嗜冷黄杆菌的生物学特性及其致病性研究：

实验从患病虹鳟溃烂肌肉处分离到2株细菌,命名为CH06和CH07株,并对分离菌株的理化特性、分类地位、致病性和耐药性开展了深入研究,以期为该病的防控提供参考。

结果表明,CH06和CH07株在胰蛋白酵母提取物(tryptone yeast extract salts,TYES)琼脂平板上呈煎蛋状外观,产黄色素,氧化酶和过氧化氢酶阳性,能水解明胶和酪蛋白,不能水解淀粉,不能利用果糖、半乳糖和七叶苷等。16S r RNA比对结果显示,CH06和CH07株与嗜冷黄杆菌模式株NBRC 15942的同源性分别为99.35%和99.42%。

本研究还探索了嗜冷黄杆菌肌肉注射感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)后病原菌在鱼组织内的动态分布情况,以期为BCWD的防控提供理论支撑。以1.0×108CFU/m L浓度的嗜冷黄杆菌CH06株菌液肌肉注射感染实验虹鳟,感染后12 h、24h、96 h观察虹鳟临床症状及组织病变,并利用嗜冷黄杆菌PCR试剂盒检测各组织病原载量。

患病鱼的临床病征表现为体色发黑,游动缓慢或不动,食欲不振,尾柄部注射处肌肉溃烂,鳃苍白,脾脏肿大,伴有腹水。组织病理观察显示,嗜冷黄杆菌感染后实验鱼注射处肌纤维断裂、溶解;脾窦扩张,其内充满红细胞;肾脏组织含铁血黄素增加,出现大量空泡变性,肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质炎性细胞浸润。嗜冷黄杆菌PCR试剂盒检测结果表明,肌肉注射感染12 h后即可在脾脏、肝脏、肾脏、肠道、鳃、脑和尾鳍中检出嗜冷黄杆菌,鳃病原载量最高为(1.62±0.28)×103copy/μL。

感染后24 h,脾脏、脑中病原载量较12 h时上升最多,其他组织病原载量与感染12 h时水平一致,脾脏病原载量为(1.26±0.37)×104copy/μL,显著高于其他组织(P<0.05)。感染96 h后脾脏中的病原载量显著高于其他组织(P<0.05),达到(1.15±0.58)×107copy/μL;肝脏、肾脏、脾脏中的病原载量较24 h时上升最多。所有被检组织中病原菌载量随时间延长均呈上升趋势。另外,三个时间点脾脏的病原平均载量最高,其次为肾脏,然后是鳃。嗜冷黄杆菌人工感染虹鳟后,脾脏是细菌的重要增殖场所。

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