麦芽香肉杆菌PCR试剂盒的知识与应用及使用方法！

                    麦芽香肉杆菌PCR试剂盒的知识与应用及使用方法！

一、背景

麦芽香肉杆菌PCR试剂盒采用PCR技术，针对麦芽香肉杆菌的基因高度保守区域设计特异性引物，用PCR技术对麦芽香肉杆菌的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含麦芽香肉杆菌核酸模板的情况下，PCR反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有猪细小病毒源性成分，实现检测结果的定性分析。

二、麦芽香肉杆菌PCR试剂盒使用方法

1、样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

取悬浮的口腔样本或粪便样本100ul，加入1.5ml离心管中，用DNA核酸提取试剂盒进行提取即可。

1.2 DNA提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

2、试剂配制（试剂准备区）

2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，

2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。

2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3、加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

备注：模板浓度高或存在PCR抑制物，需用超纯水稀释模板DNA，DNA浓度低于50ng/ul，可加5μL模板，高浓度DNA可能抑制PCR反应。

4、PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于PCR仪反应槽内,并记录放置顺序；

5、结果分析判定

5.1电泳检测

取10-20μL PCR产物。电泳检测PCR产物。本产品提供的扩增液在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加loading buffer。

5.2麦芽香肉杆菌PCR试剂盒电泳结果判断

PCR产物阳性对照必须有目的片段大小的条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释10倍后重复PCR扩增以排除PCR抑制剂的感染。

三、应用

麦芽香肉杆菌PCR试剂盒可以用于猪源沙门菌分离鉴定及鼠李糖乳杆菌预防断奶仔猪腹泻效果研究：

研究主要从沙门菌临床株分离鉴定、沙门菌ELISA(Enzyme linked immuno sorbentassay)检测方法建立与应用、LGG对沙门菌感染仔猪肠道菌群影响,以及实际生产中LGG对断奶仔猪生长性能和免疫功能影响等方面进行研究,

主要结果如下：

(1)断奶仔猪腹泻沙门菌的分离鉴定与耐药性检测。从全国26个省市,123家养殖场采集的806份腹泻仔猪肠道内容物、粪便样品中,分离得到173株沙门菌,分离率比较高的省市是河北、山东、湖南、湖北、重庆;鉴定出7种血清型,以鼠伤寒沙门菌为主(125株),16种毒力基因的阳性率为100%;氨苄西林、四环素、氯霉素和氟苯尼考的耐药率大于70%,复方新诺明的耐药率为100%,但均对阿米卡星敏感。

(2)鼠伤寒沙门菌FljB抗体间接ELISA建立与应用。对分离的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FljB进行原核表达,建立了沙门菌间接ELISA检测方法。建立的程序为pET-32a-FljB重组蛋白,以6μg/mL包被酶标板,37℃孵育1 h后4℃过夜,5%BSA封闭2h,待检血清100μ/孔,37℃作用30min,1:10000稀释的酶标二抗,100μL/孔,37℃作用30min,TMB显色10min,加入终止液,酶标仪OD450读取数值,并确定了OD450的阴阳临界值为0.34。建立的ELISA方法能特异性识别沙门菌,灵敏度高,三次的重复试验变异系数为1.0%～9.1%,且与商品试剂盒符合率达到93.4%。

(3)LGG对临床分离沙门菌感染断奶仔猪肠道菌群结构的影响。利用高通量测序技术分析回肠黏膜菌群,结果显示,仔猪回肠黏膜的优势菌群是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门,分别占总丰度的85.00%、8.23%、6.15%。经对比,鱼乳酸杆菌、土壤芽胞杆菌、乳酸乳球菌是相对丰度最高的种,分别为43.63%、8.50%、8.00%,另外,盖氏假单胞菌(2.06%)、大洋沉积物芽胞杆菌(1.49%)、微杆菌AT1b(1.27%)、麦芽香肉杆菌(1.11%;使用商品化的麦芽香肉杆菌PCR试剂盒检测)的相对丰度也超过1%。

(4)LGG对断奶仔猪生产性能和免疫功能的影响。按照1 kg/1000 kg饲料的比例添加LGG冻干粉(1010CFU/g),断奶仔猪连续饲喂3周,LGG停止添加后再继续观察2周。添加LGG提高仔猪终末重,提高平均日增重及饲料转化率,降低腹泻发病率。添加LGG显著提高第4、5周的仔猪体重,增加第3、4、5周的平均日增重及饲料转化率,可以显著降低第3、4、5周的仔猪腹泻率。对血液免疫球蛋白分析发现,LGG提高了第1周仔猪血液IgM及第3、4、5周仔猪血液IgG的浓度,第5周仔猪血液IgA浓度明显升高。

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