MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系的知识与应用！

                MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系的知识与应用！

一、背景

MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系是由A.Yunis等人于1975年从一名65岁的高加索男性获得的胰腺肿瘤组织中建立的。据报道，该细胞系倍增时间约40小时，在软琼脂中的集落形成效率约19％。该细胞系对天冬酰胺酶敏感。

二、MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系培养步骤

（一）MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

（二）MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

（三）MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

三、应用

MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系可以用于Linc00152对胰腺癌细胞MIA PaCa-2增殖侵袭及迁移的影响：

探讨长链非编码RNA Linc00152对人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2增殖、侵袭和迁移能力的影响。

方法：于医院胆胰科采集到20对胰腺癌组织和其对应的癌旁正常的胰腺组织;人正常胰腺细胞HPDE及各组胰腺癌细胞系MIA PaCa-2细胞、BxPC-3细胞、Capan2细胞购于美国ATCC细胞库。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证组织及各组细胞中Linc00152的表达水平。

人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2细胞随机分为阴性对照组(si-NC组)和Linc00152下调组(si-Linc00152组)。设计Linc00152的siRNA(small interfering RNA)干扰模型,si-NC组和si-Linc00152组分别转染阴性对照序列(Negative control)、siRNA抑制序列,采用RT-qPCR验证两组MIA PaCa-2细胞中Linc00152的转染效率并进行后续实验。

采用CCK-8法和集落形成实验检测两组MIA PaCa-2细胞的增殖能力;流式细胞术检测两组MIA PaCa-2细胞的细胞周期;Western-blot检测两组胰腺癌细胞MIA PaCa-2的细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4的表达:

采用Transwell实验和细胞划痕实验测两组MIA PaCa-2细胞的侵袭、迁移能力;Western-blot检测两组MIA PaCa-2的细胞相关蛋白vimentin及N-cadherin的表达水平。结果:与癌旁正常的胰腺组织相比,Linc00152在胰腺癌组织中表达明显增加(P<0.001),Linc00152在胰腺癌细胞系中的表达均高于人正常胰腺细胞HPDE,且在MIA PaCa-2中表达最高(P<0.01)。

成功设计siRNA干扰模型,将阴性对照序列、siRNA抑制序列转染48 h后,RT-qPCR结果显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中的Linc00152表达明显降低(P<0.01)。分别于6 h、24 h、48 h、72 h、96 h加CCK-8溶液测两组MIA PaCa-2的细胞活力,结果与si-NC组相比,si-Linc00152组中的细胞在48 h、72 h、96 h增殖显著下降(P<0.01)。

集落形成实验8天后,si-NC组的集落形成数目是(412±12),而si-Linc00152组的集落形成是(226±8),结果显示沉默Linc00152后细胞克隆数目明显减少(P<0.01)。流式细胞术结果显示沉默Linc00152后,与si-NC组相比,si-Linc00152组MIA PaCa-2在细胞周期中的G0/G1期百分比上升,提示发生了细胞周期阻滞(P<0.01)。

Transwell侵袭实验显示,沉默Linc00152后细胞侵袭的数目明显减少(P<0.01)。Transwell迁移实验中显示,沉默Linc00152后细胞迁移的数目明显减少(P<0.01)。细胞划痕实验结果均显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中细胞迁移,侵袭能力也显著降低(P<0.01)。

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