大鼠子宫成纤维细胞的背景与应用及研究动态！

                    大鼠子宫成纤维细胞的背景与应用及研究动态！

一、背景

大鼠子宫成纤维细胞是一种在特定实验室条件下培养的细胞。它们是从新鲜的大鼠组织中分离出来的，可以用于各种实验研究。这些细胞通常用于研究子宫的生物学和生理学特性，以及与子宫相关的疾病和治疗方法。

大鼠子宫成纤维细胞具有特定的形态和功能特征，包括细胞形态、细胞成分、生长和繁殖方式等。在实验室中，这些细胞通常在特定的培养基中生长，以提供最佳的生长条件，并需要适当的营养、温度和湿度等环境因素。

二、大鼠子宫成纤维细胞培养步骤

1、大鼠子宫成纤维细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）大鼠子宫成纤维细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、大鼠子宫成纤维细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）大鼠子宫成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠子宫成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

三、应用

大鼠子宫成纤维细胞可以用于体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向子宫韧带成纤维细胞分化的研究：

在体外通过非接触式共培养诱导BMSCs向子宫韧带成纤维细胞的分化,为从组织工程学角度以根源上治疗PFD疾病提供可能的研究思路及新的治疗手段。

研究方法：

1、大鼠BMSCs的体外分离培养：采用密度梯度离心法结合传代贴壁筛选法分离纯化获得大鼠BMSCs;通过形态学观察、细胞生长曲线绘制、细胞表面特异抗原及细胞周期的流式细胞学检测,对体外培养获得的BMSCs进行初步鉴定；采用体外诱导大鼠BMSCs向成骨细胞和成脂细胞的分化,对获得的BMSCs的生物学功能进行鉴定。

2、大鼠子宫韧带成纤维细胞的体外分离培养及鉴定：采用大鼠子宫韧带组织块酶消化法,进行子宫韧带成纤维细胞的原代培养,通过形态学观察、细胞生长曲线的绘制及免疫组化测定其胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表达对获得的子宫韧带成纤维细胞进行鉴定。

3、对大鼠子宫韧带成纤维细胞进行体外机械牵张,建立机械牵张损伤模型：根据韧带成纤维细胞的生物学特性,在细胞牵张仪上采用负载10%应力,1赫兹的机械牵张刺激大鼠子宫韧带成纤维细胞3h、6h、12h、24h、36h不同时间段后,通过透射电镜、鬼笔环肽染色观察不同时间牵张损伤后成纤维细胞的超微结构和细胞骨架的变化情况；采用实时定量RT-PCR技术测定不同时间牵张损伤后成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的合成能力；用台盼蓝染色观察细胞的凋亡情况。

4、大鼠BMSCs与大鼠子宫韧带成纤维细胞共培养体系的建立：将大鼠BMSCs与正常及不同牵张时间后的大鼠子宫韧带成纤维细胞间接共培养3、6、12天,采用实时定量RT-PCR检测BMSCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5 mRNA的表达情况；采用免疫蛋白印记法(western-blot)检测BMSCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情况。应用SPSS16.0软件包进行数据处理。所有数据结果均采用平均数±标准差(χ±s)表示。用one-way ANOVA检验样本与对照组的组间差异,以a=0.05作为检验水准。

实验结果：

1、体外获得的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),其细胞形态均一,呈梭形、扁平形,增殖至细胞融合时,细胞为典型的长梭形,呈集落样或放射状排列,有一定的极性;检测第四代大鼠BMSCs表面特异抗原分子,99.0%以上细胞CD90表达阳性,98.8%以上的细胞CD44表达阳性,CD34、CD45均表达阴性,分别为1.8%和3.7%；细胞周期结果显示：第4代BMSCs处于G0/G1期的细胞约为80%以上,表明大多数细胞处于静止期；细胞生长曲线典型,且所得细胞可被诱导为成骨和成脂细胞,符合间充质干细胞的特征。

2、体外成功获得子宫韧带成纤维细胞,细胞贴壁生长,形态呈梭形,与典型的成纤维细胞形态相似；细胞生长曲线典型,免疫组化测定其胶原Ⅰ、Ⅲ型蛋白的表达均符合韧带成纤维细胞特征。

3、本实验以1Hz的强度,负载10%牵张刺激细胞,用荧光物质(鬼笔环肽和DAPI)分别对所得细胞内F-actin和细胞核进行特异性标记,结果提示：F-actin在机械牵张下发生了解聚和重排。力学牵张短时间内子宫韧带成纤维细胞未出现明显变化,长时间刺激后细胞变狭长,排列无序,超微结构出现损伤,甚至出现凋亡。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！