脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒的使用方法及应用！

                 脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒的使用方法及应用！

一、背景

脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒采用SYBR Green染料法实时荧光PCR技术，针对脑膜炎败血金黄杆菌的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光PCR技术对脑膜炎败血金黄杆菌的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含脑膜炎败血金黄杆菌核酸模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

二、脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒使用方法

1、样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

按照试剂盒操作说明或者临床样品处理方法做好样品前处理。

1.2 DNA提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)

2、试剂配制（试剂准备区）

2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)。

2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。

2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3、加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

4、PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内。

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL。

荧光通道选择：检测通道荧光染料法(SYBR Green I)，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

4.3按照脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒说明书设置循环参数

5、脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：检测结果Ct值无Ct值，无明显的扩增曲线。

三、应用

脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒可以用于金黄杆菌临床分离株耐药性分析及β-内酰胺酶基因型研究：

1、了解临床分离金黄杆菌对常用抗菌药物的耐药特性;

2、了解金黄杆菌β-内酰胺酶产生情况;

3、研究金黄杆菌β-内酰胺酶基因型及分布情况。

材料与方法：菌株来源共收集金黄杆菌52株,其中主要为产吲哚黄杆菌和脑膜脓毒性金杆菌,分别为25株和23株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603、阴沟肠杆菌029M、接合试验受体菌E.coli C600和铜绿假单胞菌pa119均为本科保存菌株。

方法：琼脂稀释法测定18种药物对52株金黄杆菌的最低抑菌浓度,三纸片增效法、改良三维试验法进行金黄杆菌产β-内酰胺酶表型筛查,PCR方法和全编码基因分析β-内酰胺酶基因型,接合转移试验和质粒DNA的检测了解β-内酰胺酶基因是否具有可转移性,等电聚焦电泳测定β-内酰胺酶的pI值。

结果：52株金黄杆菌对碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南的耐药率为73.1%,氨曲南为90.4%,阿米卡星和β-内酰胺抗生素的耐药率均大于40%。喹诺酮类药物加替沙星、左氧氟沙星耐药率为11.5%、9.6%,以及利福平8.7%,均表现出很强的抗菌活性。

金黄杆菌β-内酰胺酶检测结果,25株产吲哚黄杆菌的表型和PCR方法分别检测出MBLs 19株和20株,基因型以bla IND-1和bla IND-2为主,分别为9株和10株,菌株C-15携带bla IND-1,MBLs表型检测及β-内酰胺酶初筛均为阴性。

14株脑膜脓毒性金杆菌表型和PCR方法分别检测出MBLs 17株,基因型为blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株。仅7株细菌检出产ESBLs,均为脑膜脓毒性金杆菌,基因型为3株blaCME-1和4株blaCME-2,其中5株细菌同时检出MBLs。52株细菌均未检出产AmpC酶。携带β-内酰胺酶基因的金黄杆菌接合试验均未成功。质粒DNA均未检出β-内酰胺酶基因。

结论：

1、金黄杆菌多重耐药现象严重,对碳青霉烯类等多种抗菌药物呈高度耐药;

2、脑膜脓毒性金杆菌具有较高的ESBLs和MBLs携带率,基因型分别以blaCME和blaB为主,可同时携带两种MBLs基因,且blaCME常和MBLs基因同时携带;

3、产吲哚黄杆菌具有很高的MBLs检出率,本地区携带的MBLs基因型以bla IND-1和bla IND-2为主。

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