急性早幼粒细胞株的培养步骤与应用及研究动态！

                    急性早幼粒细胞株的培养步骤与应用及研究动态！

一、背景

急性早幼粒细胞株来源1989年第二次复发的急性早幼粒细胞白血病（APL；FAB命名法中的M3）患者的骨髓。

二、急性早幼粒细胞株培养步骤

1）复苏急性早幼粒细胞株细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）急性早幼粒细胞株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮急性早幼粒细胞株细胞，传代可参考以下方法：

1、收集急性早幼粒细胞株细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

2、可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

3）急性早幼粒细胞株细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

三、应用

急性早幼粒细胞株可以用于低剂量PRF诱导的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞自噬与分化的作用机制：

探讨低剂量PRF诱导的NB4细胞自噬在NB4细胞生存及转归中的作用,利用自噬以及MEK/ERK相关信号分子的变化等揭示可能的分子机制。

研究方法：

1、低剂量PRF对NB4细胞自噬表达的影响NB4细胞经梯度浓度(0、5、10、15μg/ml)PRF处理48h,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达变化;qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)技术检测自噬相关基因ATG5、Beclin1的表达变化;10μg/mlPRF作用48h后,单丹磺酰尸胺(MDC)染色及透射电镜技术检测NB4细胞中自噬小体的变化。

2、自噬在低剂量PRF诱导NB4细胞分化的作用NB4细胞经3MA(5mM)预处理1h后,再给予PRF(10μg/ml)作用48h,采用WB检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1以及PML-RARα融合蛋白的表达变化;采用瑞士-吉姆萨染色(Giemsa-Wright’s staining)检测NB4细胞形态学改变情况;采用流式细胞术(FCM)来检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达阳性率以及细胞改变。

3、低剂量PRF诱导NB4细胞自噬及分化可能的分子机制NB4细胞经10μg/mlPRF作用48h后,运用WB检测MEK和ERK1蛋白的表达水平。采用该通路抑制剂SCH772984(10μM)预处理NB4细胞1h后,再给予10μg/mlPRF作用48h,WB检测ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα蛋白表达的变化;MDC染色和Giemsa-Wright’s staining观察NB4细胞中酸性自噬溶酶体和细胞形态学的变化;运用FCM检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达以及细胞周期变化;qRT-PCR技术分析不同浓度梯度(0、5、10、15μg/ml)PRF作用48h后的NB4细胞以及抑制剂SCH772984(10μM)预处理后ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα在mRNA水平的表达。

研究结果：

1、PRF体外可诱导NB4细胞自噬。PRF(10μg/ml)药物作用48h后自噬水平提升明显,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的表达升高;ATG5及Beclin1在mRNA水平表达增多;PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达减少;细胞中自噬小体的数量增多。

2、自噬抑制剂3MA(5mM)预处理1h,再予以PRF(10μg/ml)作用48h后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达下调,融合蛋白PML-RARα的表达下调,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;抑制NB4细胞向正常粒细胞分化的形态学也发生改变,阻断自噬也降低了PRF诱导的CD11b表达下降,抑制了细胞周期阻滞在G0/G1期的现象。

3、PRF(10μg/ml)作用NB4细胞48h后可显著上调MEK和ERK1的蛋白表达水平。通路抑制剂SCH772984(10μM)预处理1h后,10μg/ml PRF诱导的ERK1、LC3-Ⅱ的蛋白表达及PML-RARα的降解程度均受抑,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;NB4细胞中酸性自噬溶酶体比例下降,抑制细胞形态改变,表面分化抗原CD11b表达下调,表明NB4细胞分化受阻。

结论：低剂量(10μg/ml)PRF通过激活MEK/ERK信号通路促进NB4细胞的自噬,引起致癌蛋白PML-RARα的降解,最终诱导NB4细胞向正常粒细胞分化。低剂量(10μg/ml)PRF诱导的NB4细胞自噬与分化之间的关系有待进一步通过体内实验验证。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！