UMR-106大鼠骨肉瘤细胞的应用与处理方法！

          UMR-106大鼠骨肉瘤细胞的应用与处理方法！

一、背景

UMR-106大鼠骨肉瘤细胞是注射放射性同位素磷(32P)诱导产生的可移植性大鼠骨肉瘤克隆建立的细胞系。UMR-106细胞对PTH、前列腺素及破骨甾体有响应。UMR-106细胞对PTH的响应度比相关细胞株UMR-108要高；蛋白激酶C的活化抑制ATP诱导的胞内钙水平的升高。

培养条件：DMEM＋10%FBS＋1%P/S；气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

二、细胞处理方法

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

将0.25%胰酶-0.53 mM EDTA消化液置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2 ml预热好的胰酶，置于37°孵育消化（第一次消化需时常取出置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为最佳消化时间，记录最佳消化时间，以便于下次消化），消化好后加入3ml完全培养基终止消化。

用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。

三、应用

用于KISS1/GPR54系统对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞及原位移植瘤模型的作用研究：

1、构建大鼠骨肉瘤“原位移植-肺转移”模型，为研究KISS1/GPR54系统对大鼠骨肉瘤的影响构建实验平台。

2、检测KISS1/GPR54系统在大鼠骨组织和骨肉瘤模型中的表达。

3、研究KISS1的多肽片段对骨肉瘤UMR-106细胞迁移、侵袭能力的影响。

4、构建大鼠KISS1基因重组慢病毒并感染UMR-106细胞，获得稳定表达外源性KISS1基因的UMR-106细胞。

5、探讨大鼠KISS1基因修饰对于大鼠骨肉瘤的影响及可能机制。

方法：

1、使用钡剂测定大鼠胫骨骨髓腔容积，向骨髓腔内注射适量的大鼠骨肉瘤UMR-106细胞悬液，观察胫骨原位肿瘤生长和肺部转移情况，应用RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）在细胞、原位肿瘤和肺转移结节中的表达。

2、采用RT-PCR法和Western Blot法，从mRNA水平和蛋白水平检测KISS1和GPR54在大鼠骨组织、UMR-106细胞、裸鼠模型的原位肿瘤组织中的表达情况。

3、采用50nM、100nM、200nM三个剂量的Kp-10（Kisspeptin10肽片段）作用于UMR-106单细胞层，划痕实验和Transwell实验分别观察细胞迁移和侵袭能力的变化。

4、构建携带大鼠KISS1基因的重组慢病毒并感染UMR-106细胞，通过荧光表达法判定感染复数（Multiplicities of Infection,MOI），Western Blot检测感染前后的细胞中KISS1蛋白的表达情况。

5、体外实验：划痕实验和Transwell实验测定转染前后各组细胞的迁移、侵袭能力的变化。Western Blot检测转染前后各组细胞MMPs，TIMPs的表达变化。体内实验：观察转染前后各组细胞原位模型的肿瘤大小和肺转移结节的数量。

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