球孢白僵菌的实验内容与注意事项！

                   球孢白僵菌的实验内容与注意事项！

球孢白僵菌Beauveria bassiana 属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属，是广谱性昆虫病原真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子；可进行有性生殖并产生子实体，被鉴定为球孢虫草。球孢白僵菌在世界范围被用于害虫生物防治，其中我国使用球孢白僵菌防治马尾松毛虫和玉米螟是国际上最大的害虫防治项目，取得良好的害虫持续控制效果。

一、菌种简介

平台编号：Bio-52613

规格：冻干物

拉丁属名：Beauveria Bassiana (Balsamo) Vuillemin

菌株名称：球孢白僵菌

其他编号：ACCC 30006

培养基编号：14

培养温度：24-28℃

用途：生物防治

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

二、培养基

综合马铃薯培养基（PDA）

20%马铃薯汁 1L 葡萄糖 20g MgSO4.7H2O 1.5g KH2PO4 3g

Vitanib B1 (硫胺素) Trace 微量约 8mg Agar (琼脂) 20g pH 自然

20%马铃薯汁配制方法：马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块 , 加水 1000 毫升煮沸 20 分钟后滤去马铃薯块，将滤液补足 1000ml。 

三、实验内容

1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 

2、干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 

3、高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 

4、过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌

四、保藏条件

斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。 

五、保存方法

1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于*适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

3、悬液保存法：

① 蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

② 糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。

4、载体保存法：①土壤保存法；②砂土保存法；③硅胶保存法；④磁珠保存法；⑤麸皮保存法；⑥纸片(滤纸)保存法。

5、常用的冷冻保存法：

①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。

②干冰保存法(-70℃左右)：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。

③液氮保存法(-196℃)：是适用范围较广的微生物保存法。

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3ml 适宜的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支平板或者斜面）；

2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

7）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；

8）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

10）西林瓶开封：用 75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖， 注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用 75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入 0.2ml 适宜的液体培养基复溶冻干粉末。