人前列腺癌细胞的传代流程与应用！

                  人前列腺癌细胞的传代流程与应用！

一、背景

LNCAP人前列腺癌细胞是从一位50岁白人男性(血型B+)的左锁骨淋巴结针刺活检中分离，该患者经确诊为前列腺癌转移。LNCaP clone FGC细胞对5-α-二氢睾酮(生长调节子和酸性磷酸脂酶产物)有响应。

LNCaP clone FGC细胞并不形成一致的单层，而是形成集落，在传代时可以用滴管反复吹吸打碎。LNCaP clone FGC细胞仅仅轻轻地吸附在基底上，不形成汇合，很快使培养基变酸。LNCaP clone FGC细胞生长极其缓慢，传代后48小时内不应扰动。

当培养瓶封包后，多数LNCaP clone FGC细胞从培养瓶底分离，悬浮在培养基中。收到后，在通常培养单层细胞的条件下培养24-48小时，以使细胞再贴壁。此后，可以换上新鲜培养液。如果需要，培养瓶内容物可以收集，300g离心15分钟，以10毫升培养液重悬并培养到一个单独的培养瓶中。

二、细胞传代流程

（1）吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2-3ml0.25%胰酶进行消化细胞（注意把握消化时间，通常控制在1-2min）

（2）注意培养基PH值变化情况，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存

（3）取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养

（4）镜下观察消化情况，在HS505.T人淋巴结成纤维样细胞生长特性边缘缩小，贴壁松动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6-8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。

三、应用

用于GNMT的表达及调控对人前列腺癌细胞系LNCap和PC3生物学特性的影响研究：

研究GNMT的体外调控对人前列腺癌细胞系LNCap和PC3的分化、凋亡、增殖和侵袭性等各项生物学特性的影响。

方法：细胞培养液中分别加入GNMT（10μg/ml）和SAH（10ng/ml）来上调和下调LNCap和PC3细胞内GNMT的活性。在12h、24h、36h和48h这4个时间点,光镜下观察细胞分化,TUNEL和流式细胞法检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭性。

结果：①光镜观察第48h,GNMT和SAH处理过的LNCap和PC3细胞形态在200倍光镜下观察,均没有发生明显变化,延长培养时间至5d后结果仍是一样。

②TUNEL两种细胞中凋亡率,GNMT组均低于对照组,SAH组均高于对照组。其差异在LNCap细胞中GNMT组和对照组之间,第48h无统计学意义,p>0.05,第12h、24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,4个时间点均有统计学意义,p<0.05。在PC3细胞中GNMT组和对照组之间,第12h和48h无统计学意义,p>0.05,第24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,第12h无统计学意义,p>0.05,第24h、36h和48h有统计学意义,p<0.05。

③流式细胞两种细胞中凋亡率,GNMT组均低于对照组,SAH组均高于对照组。其差异在LNCap细胞中3组之间两两比较,4个时间点均有显著统计学意义,p<0.01。在PC3细胞中GNMT组和对照组之间,第48h无统计学意义,p>0.05,第12h、24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,4个时间点均有显著统计学意义,p<0.01。

④MTT两种细胞中吸光度值,GNMT组均高于对照组,SAH组均低于对照组。其差异只在PC3细胞中的48h时间点SAH组与对照组之间有统计学意义,p<0.05。

⑤Transwell两种细胞中穿膜细胞数,GNMT组均高于对照组,SAH组均低于对照组。其差异在两种细胞中均在36h和48h时间点才有统计学意义,p<0.05。