肺炎衣原体的鉴定检测方法及预防与控制！

              肺炎衣原体的鉴定检测方法及预防与控制！

肺炎衣原体（C. pneumoniae）仅有TWAR 一个血清型。1965年从台湾小学生眼结膜标本中分离到一株新型衣原体，命名为TW-183；1983年从美国西雅图患急性呼吸道感染的大学生咽部标本中也分离出一株新型衣原体，命名为AR-39；后发现TW-183和AR-39株同为一种衣原体，1986年合并上述两株衣原体字母命名为TWAR血清型。 

一、生物学分类

1965年，我国台湾地区小学生进行沙眼的疫苗检测时，从沙眼患者的结膜中分离出一种新的衣原体，分离出的头两株分别命名为TW-183和AR-39，最初认为它是沙眼衣原体简称CT的一个株，并将此株统称为TWAR。进一步对衣原体的原体超微结构及DNA分析研究后，发现TWAR既不同于CT，又不同于鹦鹉热衣原体，简称Cpn。那时，肺炎衣原体中只有TWAR这一株被确定，于是，1989年，正式命名TWAR株为肺炎衣原体( Chlamydia pneumoniae，Cpn)，归属于衣原体属内的第三个种。 

根据遗传性和生物学特性，肺炎衣原体可分为 TWAR、 考拉和马 3 个生物变种。 代表株为 TW-183T（ ATCC VR 2282T）。 TWAR 是由第一次分离到的 2 株 TW-183 和 AR-39的名字合并而成。TWAR 生物变种仅是从人分离到，同时也只有 1 个血清变种。 TWAR 对呼吸系统有致病性，最突出的是引起急性或慢性支气管炎和肺炎。此外， 还与急性或慢性呼吸道疾病如中耳炎、肺阻塞性疾病以及动脉粥样硬化、哮喘、 结节性红斑、反应性呼吸道疾病、Reiter 氏综合征、肉样瘤病等有关。参考株是 TW-183T。肺炎嗜性衣原体考拉生物变种其 MOMP 属于 1 型， 与 TWAR 蛋白同源性为 97.8%，与马生物变种 MOMP 同源性为94.5%，而与其他衣原体的 MOMP 同源性低于 70%。参考株为 LPCon。目前，肺炎嗜性衣原体马生物变种只有一个分离株 N16，是 1990 年 Wills 等从马呼吸系统分离到的。其MOMP 与肺炎嗜性衣原体其他株的差异性为 5.5%； 而与衣原体其他种的差异性则>30%。用 N16 分离株接种马可引起无症状感染，参考株为 N16。 

二、生物学性状

1、基本形态

Cpn在Hela229中培养，其外形极像鹦鹉热衣原体（Cps），但碘染色阴性且不挤压细胞核。既往认为电镜观察Cpn，其明显特征为其外形为梨形，平均直径为380nm，其长轴为440nm，短轴为310nm。姬姆萨染色法可着色，革兰氏染色不着色。核区和细胞膜之间有较宽的原生质区。而Cps和沙眼衣原体（CT）均为圆形。CP菌株YK-41、10L-207及K6菌株也被证实为圆形。现认为，Cpn、CT和Cps的包涵体凸面有很多颗粒呈六角形排列，用激光束转换的方法研究Cpn的原体外形发现，其表面的六角形结构有相似的周期性，在Cpn原体的复制繁殖过程中，普遍存在线粒体与包涵体并不相关现象，具体机制有待阐明。 

2、培养特性和生化特性

肺炎衣原体不能体外培养，只能在细胞内寄生，鸡胚对其不敏感，因此一般不用鸡胚传代，而用细胞培养传代，肺炎衣原体敏感的细胞株为HEP-2或H-292，离心能促进肺炎衣原体对细胞的感染，但在第一代细胞内很少能形成包涵体。肺炎衣原体包涵体不含糖原，碘染色阴性，在Hela细胞中的形态与鹦鹉热衣原体十分相似，姬姆萨染色后呈深密度卵圆形，在HEP-2细胞中的包涵体，其密度和形态均多样化，有致密的、桂花样散在的、伸出胞外出瘤状的、圆形、胞内着色较少的包涵体。CPn的抵抗力较弱，对室温或冰冻敏感。 

Cpn无运动力，能独立进行有限的代谢活动；染色体有DNA和RNA两种核酸，只能在细胞内复制、繁殖，发育周期分为原体（elementarybody，EB）和始体（initialbody），也称为网状体（reticulatebody，RB）两阶段。原体平均直径为0.38nm，在电镜下呈梨形，并有清晰的周浆间隙，原体中无质粒DNA。Giemsa染色呈紫色，Macchiavello染色呈红色。原体具有高度感染性，在宿主细胞外较为稳定，无繁殖能力。当进入宿主易感细胞后，细胞膜围于原体外形成空泡。原体在空泡中逐渐发育、增大成为始体。 

始体呈圆形或椭圆形，体大，直径0.5～1nm，电子致密度较低，无胞壁，代谢活泼，以二分裂方式繁殖，在空泡内发育成许多子代原体。最后，成熟的子代原体从破坏的感染细胞中释出；再感染新的易感细胞，开始新的发育周期。每个发育周期约为48h、72h。始体是衣原体发育周期中的繁殖型，不具感染性。Macchiavello染色呈蓝色。

3、毒性

肺炎衣原体毒力较低，3代之内不能致死鸡胚，小鼠鼻内、脑内和静脉内接种，不引起小鼠死亡，猴结膜内接种，不发生滤泡性结膜炎。对药物的抗菌谱类似其他衣原体，耐磺胺类药物。 

三、发病机制

肺炎衣原体感染发病机制尚不明确。肺炎衣原体侵入人体后，主要引起单核-巨噬细胞反应，肺泡巨噬细胞作为病原体贮存和传播的载体，造成其在宿主体内的持续感染。在非人哺乳动物如小鼠及猴的动物实验研究中发现，感染早期多无症状，大部分在2个月出现肺部病变，主要表现为间质性肺炎，早期局部有多核细胞浸润，以后则为巨噬细胞和淋巴细胞浸润。可从肺部及脾脏中分离出肺炎衣原体。其感染易转为慢性，与许多慢性感染有关，如冠心病、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病、支气管哮喘、结节病及反应性关节炎等。 

1、黏附素

肺炎衣原体黏附于上皮细胞是衣原体在细胞内生长、繁殖并导致病变的前提。衣原体通过创面侵入机体后，原体吸附于易感的柱状或杯状黏膜上皮细胞并在其中繁殖，其中，MOMP作为黏附因素之一发挥了重要作用，它可与宿主细胞受体一硫酸乙酰肝素结合，促进肺炎衣原体吸附于宿主细胞表面，引起肺炎衣原体感染。最新研究表明， GroEl蛋白也可能与肺炎衣原体入侵宿主细胞有关。 

2、内毒素样物质

衣原体能产生内毒素样物质，抑制宿主细胞代谢，直接溶解宿主细胞。这种物质还可引起宿主的炎症反应和超敏反应。在慢性心血管疾病方面，肺炎衣原体的热稳定成分脂多糖(lipolysaccharides，LPS)可以引起巨噬细胞泡沫化。有研究表明，用抗衣原体LPS的单克隆抗体可以同时抑制体内外的肺炎衣原体感染。 

3、主要外膜蛋白

除了在黏附过程发挥作用外，MOMP在肺炎衣原体致病过程中还起着直接或间接的作用。有证据显示肺炎衣原体MOMP可以促进巨噬细胞分泌MMP-9(92kD明胶酶)，加强细胞外基质的蛋白水解酶活性，导致基质降解。还可促进单核细胞产生IL-1等细胞因子，从而介导炎症发生、瘢痕形成，直接损伤宿主细胞，造成相关病变。MOMP富含半胱氨酸，二硫键使这些半胱氨酸广泛交联形成网状结构，维持外膜结构的坚韧性，增强肺炎衣原体抗机械作用能力，稳定其渗透压。同时，这种结构为肺炎衣原体原体与网状体的转换提供了足够的可塑性。MOMP有类似于孔蛋白的功能，通过β-折叠形成跨膜通道，经二硫键调控开/关状态，由此控制ATP等营养物质的进出;此外，它还能阻止吞噬体与溶酶体融合.致肺炎衣原体抗吞噬，有利于其生存并破坏宿主细胞。在进化过程中，MOMP还可以发生基因突变，以此来逃避免疫反应而继续感染细胞。 

4、热休克蛋白

肺炎衣原体的热休克蛋白( heat shock protein，HsP)除了作为分子伴侣的蛋白折叠功能外，还在衣原体病的致病机制及免疫，炎症病理损伤中发挥重要作用。目前的研究显示HSP60是肺炎衣原体参与动脉粥样硬化形成的重要成分，是与冠状动脉疾病最相关的危险因子。HSP10与HSP60在遗传上密切相连，在蛋白结构和功能上也具有一定相关性。有研究发现哮喘患者体内的肺炎衣原体HSP10抗体明显高于健康对照组人群，说明肺炎衣原体HsSP10抗体与成人哮喘可能具有相关性，但具体机制有待进一步研究。HSP70与HSP60均属于免疫优势抗原，同时，HSP70可能参与衣原体对宿主细胞的黏附作用，并可能作为一种信号分子激活与炎症相关的信号通路，调节细胞因子的表达。 

5、其他

肺炎衣原体上还有多种成分参与衣原体的致病。最新研究热点之一是Ⅲ型分泌系统( type ll secrenon system，T3Ss)可能与之相关。CPAF是第一个发现的由衣原体基因编码合成并分泌到宿主细胞内的蛋白酶样活性因子，具很强免疫活性，在衣原体的致病过程中及衣原体与宿主的相互作用中发挥重要作用。另外，Pmp20、Pmp21、Cpn0980、Cpn0809及Omp2等可诱导宿主分泌细胞因子，引起多种炎症介质失控性释放，造成机体持续的炎症反应。 

四、鉴定检测方法

临床依据患者的症状和体征，很难鉴别细菌性、病毒性、肺炎支原体或肺炎衣原体的感染，以致在临床用药上存在困难，一般只能依赖实验室通过人体体液标本进行病因检测。碘染色法和姬姆萨染色法不适用于Cpn的检测。细胞免疫组织化学法对组织切片进行生物素-抗生物素-过氧化物酶系统着色（又称ABC法）。在冠状动脉硬化斑块上可检出Cpn-EB，透射电镜证明在AS泡沫细胞内有特征性的0.4µm大小的EB。该系统设备价格高昂，技术要求高，只限于科研应用。故不适合直接涂片。 

目前常用的检测方法有如下几种： 

1、分离培养

分离培养是Cpn特异性实验室诊断方法，可用鼻咽或喉拭子、痰和胸腔积液标本分离Cpn，鼻咽部拭子是进行分离的理想标本，喉和痰液分离Cpn有何差别还不清楚。Cpn需要在组织中进行培养，无细胞培养基不适合Cpn繁殖，Cpn能在呼吸道来源的细胞系如：HEp-2和HL细胞系中稳定生长。拭子采用涤棉、金属线为好，拭子既应注意防污染，亦要防止细胞和Cpn受抑制，取得的标本通常置于加抗生素和小牛血清的蔗糖磷酸缓冲液（保存于4℃，不超过24h），标本置于室温会降低其活性，如果不能在24h内处理，标本应置于−70℃冰箱保存。接种后72h，要证实菌株，可用Cpn特异性或衣原体种特异性（即抗LPS）荧光结合单克隆抗体进行染色。Cpn包涵体不包含糖原，因此不被碘染色。  

但是，肺炎衣原体的组织培养较其他衣原体困难，在作分离培养时，常采取以下措施以增强肺炎衣原体的感染性及促进其在细胞中的生长：①接种物离心（3000r/min）。②培养细胞用30µg/ml的二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-dextran）预处理。③加入细胞生长抑制剂，如环己酞亚胺1µg/ml以抑制宿主细胞生长。Kuo等在研究肺炎衣原体培养所需氨基酸时发现，赖氨酸和蛋氨酸的部分或完全缺失可不同程度地促进肺炎衣原体的生长，但该促进作用在加入环己酞亚胺后变得不明显。Theunissen等观察了SPG保存液的pH、离子强度、温度对肺炎衣原体感染HL细胞的影响，发现pH大于8或小于5，原体的存活率迅速减低；在含10%小牛血清的SPG中，外加NaCI浓度小于80mmol/L时原体的活性受到影响，而0.346～4mmol/L的Ca2+或0～2.5mmol/L的Mg2+对原体感染性的影响不明显；在0～20℃24h内，SPG中原体95%以上存活，温度超过20℃，原体的存活率随存放时间的延长下降迅速。 

2、血清学检测

最常用的血清学方法是补体结合反应。一般用加热处理过的衣原体悬浮液作为抗原（属特异抗原）来测定被检血清（属特异血清）。哺乳动物和禽类一般于感染后7d、10d出现补体结合抗体。通常采取急性和恢复期双份血清，如抗体滴度增高4倍以上，认为系阳性。关于血清学普查判定标准，国内暂定1∶16或以上为阳性，1∶8为可疑，1∶4以下为阴性。 

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA已用于痰标本的Cpn抗原检测。优点为特异性强、操作简便、易于自动化，并且可用于大批量标本的检测，另外，快速试验过程仅需1h，临界值易判断，由于可检测血清中IgM和IgG，故能区分急性感染和既往感染，适合于临床实验室作为Cpn感染的常规检查；缺点为敏感性差，阳性预期值较低，不适合人群的筛查。 

（2）微量免疫荧光抗体检测（MIF）

MIF技术对肺炎衣原体的诊断是特异的且敏感性高，因此被国内外学者誉为Cpn感染诊断的“金标准”。MIF抗体包括3种：IgM、IgG和IgA。初次感染（原发感染）时，IgM于发病后3周出现，IgG于发病后6～8周出现，而IgA反应较弱或不出现；再次感染（重复感染）时，IgG常在1～2周内出现，且效价可以很高，但往往没有IgM出现或其效价很低。目前诊断标准为：①急性感染：双份血清抗体效价升高4倍以上或IgM=1∶16或IgG≥1∶512；②既往感染：IgM<1∶16且1∶16≤IgG<1∶512；③未感染过∶IgG1∶8。总之，MIF试验是经典的国际通用的方法，对Cpn的诊断具有高度的特异性。但该方法的抗原片制作过程复杂，实验室要求条件高。 

无论采用何种检测方法，急性期及恢复期的双份血清标本中，肺炎支原体特异性抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，均可确诊为肺炎支原体感染，这是目前国际上公认的标准。 

3、分子生物学检测

用分子生物学方法检测血管组织中Cpn，结果取决于样本收集和操作、引物设计、核酸抽提、扩增物的检测以及假阳性、假阴性结果的预防与鉴别等环节。最常用的引物是omp1、16SrRNA、3SrRNA、Cpn特异性克隆PstI片断等，测定扩增产物多应用琼脂糖电泳、Southernblot、EIA、聚丙烯酰胺胶电泳等。目前分子诊断技术中已有聚合酶链反应（PCR）、套式聚合酶链反应（nPCR）、连接酶链反应（LCR）、转录介导扩增试（TMA）、基因探针杂交等方法。作为分子生物学方法，PCR法具有快速、简便、灵敏的特点，是Cpn诊断的发展方向。总之，分子生物学方法具有快速、简便、灵敏的优点，是Cpn感染诊断的重要手段。很多学者建议将各种分子生物学方法之间或与其他诊断方法联合应用，并且证明了联合应用能提高Cpn感染诊断的敏感性。如PCR与ELISA联合应用的方法诊断Cpn感染的敏感性高于免疫荧光法、传统PCR法以及ELISA法。此外，其中基因探针杂交和LCR单独使用灵敏度不足，宜与PCR联合应用。nPCR不仅特异性与灵敏度颇占优势，而且由于无须增添任何设备，能开展PCR检测的单位均可实施，是较为适合国情的方法。 

五、环境与污染源

人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。人类肺炎衣原体感染一年四季均可能发生，不呈季节性特征，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。 

一般认为肺炎衣原体感染与鸟类及其他动物无关，人类是Cpn唯一储存宿主。其传播源是患病者或无症状携带者的呼吸道分泌物和飞沫。另外肺炎衣原体在硬塑料表面能存活30h，在纸巾上能存活12h，在手上存活时间仅10～15min。健康者也可能通过接触这些带有病原体的物体而被感染。 

虽然在人肺部感染Cpn的潜伏期约为10d，65d内即可诱导产生特异性T细胞免疫和B细胞免疫，从患者血清中可检测到特异性抗体。这些感染性抗体可暂时地提供一定的机体免疫保护作用。但其免疫力不强，且维持时间短，多数情况下不能阻断再度感染而呈反复发作的状态。 

健康人群可分离出Cpn，提示存在健康的带菌者或隐性感染者。然而正是这些无症状的“健康”或“亚健康”的携带者在传播Cpn上具有重要意义。 

六、预防与控制

肺炎衣原体感染的预防应注意呼吸道隔离，隔离传染源，切断传播途径，及时治疗患病个体。如流行期不要在人群密集的地方停留时间过长，经常洗手，讲究个人卫生，强化对环境公共卫生的管理和监督。增强体质，提高自身的免疫力，是预防呼吸道感染的有效途径。 

1、要注意避免接触感染源。

Cpn的传播方式主要是人一人通过飞沫传播，也可从环境中接触后通过手自体接种。因此，要有较好的生活环境，室内要注意清洁卫生，要经常开窗换气，保持室内空气新鲜。可经常到空气新鲜的户外活动，避免到空气污浊的公共场所，外出后注意清洗面部（口鼻处）和手，特别是要避免接触已患呼吸道感染的病人。如家长患呼吸道感染要尽量少与小儿接触，如必须接触一定要戴上口罩，并注意进行室内的消毒。 

2、要注意加强身体抵抗力。

一是通过被动免疫，即预防接种来提高抵抗力。6岁前的儿童，预防接种是防患传染病的最有效办法。二是要提高主动免疫能力，如注意营养，增强体质，进行日光浴，空气浴等。 

3、要注意对引起疾病的诱因进行控制。

如环境温度的影响，要根据天气变化适当穿衣，避免引起受寒，也不要捂得太多受热。饮食也需注意，如营养不良，身体抵抗力低下，就容易被病原体侵袭，还易引起并发症。所以应消除营养不良，防治佝偻病、贫血、缺锌等营养性疾病。当然营养过剩或饮食不当也是呼吸道感染的诱因。因此，食量要适当，食物要合理，注意蔬菜，水果等富含维生素和纤维素的摄入。