菌种保藏的目的与原理及常用的方法！

               菌种保藏的目的与原理及常用的方法！

菌种保藏(culture preservation，culture collection)是指保持微生物菌株的生活力和遗传性状的技术。目的在于把从自然界分离到的野生型，或经人工选育得到的变异型纯种，使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌种原有的各种特征和生理活性。基本原理是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在zuidi范围内。干燥、低温和隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。有针对性地创造干燥、低温和隔绝空气的外界条件，就是微生物菌种保藏的基本技术。常用的方法有冻干保藏法、深低温保藏法、液氮保藏法、矿油封藏法、固体曲保藏法、砂土管保藏法、琼脂穿刺保藏法等。日常工作中，常选用4℃冰箱进行短时间的菌种保藏。 

一、目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，保持菌株优良性状不退化，保持优良菌株存活，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

二、原理

菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是运用一些方式尽量降低生物体内的代谢，达到延长生命，减少变异的目的。通常采用的方法为低温、缺氧、干燥。

低温主要对菌种产生两方面的影响，首先，较低的温度可以减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的。其次，低温同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制，如果降温过程失误，同样会造成机体的机械损伤和溶质损伤。

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。  

三、具体方法

⒈传代培养保藏法

包括又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，培养后于4-6℃冰箱内保存。

其中斜面培养法是将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌zuihao每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。

⒉液体石蜡覆盖保藏法

液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4-4℃下，液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。

具体的操作方法：

⑴将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm，121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

⑵将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

⑶用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。 

⑷将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。 

此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

⒊载体保藏法

载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

（一）沙土保藏法

⑴取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

⑵倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

⑶烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

⑷另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

⑸烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

（二）滤纸保藏法

⑴将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃灭菌30分钟。

⑵将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

⑶取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

⑷用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

⑸将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

⑹将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

⑺需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

⒋寄主保藏法

寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常见的是甘油管冷冻保藏法。

甘油管冷冻保藏法是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油-生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。

该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油-生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

⒌冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。真空冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。 

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