【知识分享】治疗性蛋白药物SEC分析方法知多少？（一）

纳谱分析

2024/06/19 13:43

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体积排阻色谱 (SEC) 是治疗性蛋白药物聚集体和片段分析的强大工具^1-3。

SEC是一种非保留分离模式，分析物基于自身流体动力学尺寸：由大到小，依次洗脱。

对于治疗性蛋白药物，聚集体在单体之前洗脱，片段在单体后洗脱。

△图1 聚集体、单体和片段依次流出

固定相孔径、孔容积和物理强度是构建高性能SEC色谱柱的关键要点：

1.治疗性蛋白药物聚集体和片段分析，最常用的SEC固定相孔径在200-300 Å范围；

2.为得到最佳分离，固定相微球（如硅胶）应具有高孔容积；与此同时，颗粒物理强度会受到影响，导致较短柱寿命，在使用过程中需要特殊关注和维护保养；

3.在保证高孔容积的基础上，需要增强固定相微球物理强度以确保SEC色谱柱的稳定性、稳健性和耐受性。

此外，SEC作为非保留分离模式，理想情况下，分析物和固定相之间不应存在相互作用，因此SEC固定相表面化学的设计和构建应确保任何次级相互作用（例如离子交换）最小化。

使用SEC分析治疗性蛋白药物时，若干要点需要关注和考虑，如下所示：

这些要点对于确保治疗性蛋白药物准确、高效和可靠的分析至关重要，特别是考虑到其复杂性和严格的药品质量标准。

以下要点将以BioCore SEC色谱柱为例，展开说明和讨论。

要点1: 流动相

为实现良好的SEC分离，需要优化色谱条件，包括流动相成分。磷酸盐缓冲液是常用流动相；屏蔽不需要的蛋白与固定相之间的离子交换作用，通常在流动相中添加一定浓度的盐（常用300 mM NaCl）：较低的盐浓度（例如<0.1 M）可能无法充分抑制离子交换作用，而较高的盐浓度（例如>1.0 M）可能会引起疏水相互作用。

BioCore SEC色谱柱具备独特的表面化学，确保最小的离子交换作用：溶菌酶（pI=10.2）出峰时间在不同浓度的缓冲液流动相下表现出良好一致性。在同等条件下，一款著名SEC色谱柱显示溶菌酶出峰时间随缓冲液浓度的降低而增加（如图3所示），表明该款SEC色谱柱存在显著的离子交换作用。

△图3 BioCore SEC与知名品牌SEC色谱柱次级作用力对比

SEC是非保留分离模式，需要确保分析物和固定相之间的相互作用最小化。然而，一些抗体相关生物制剂，例如抗体偶联药物（ADC），由于连接臂和小分子毒素的存在，可能会产生明显的疏水相互作用。在流动相中添加低比例有机溶剂（如乙腈或异丙醇），可能会有助于提高分辨率。如图4所示，当流动相中加入10%乙腈时，ADC单体峰洗脱时间稍早，半峰宽更窄，峰形更好。与此同时，片段可以更好地从单体峰中分离出来。

△图4 流动相中添加有机溶剂对分离的影响

精氨酸是SEC流动相的有效添加剂，可以抑制治疗性蛋白药物和固定相之间的非特异性作用，改善单体和聚集体的分离及其回收率。图5展示精氨酸和氯化钠对聚乙二醇化蛋白分离的影响：在流动相中添加300 mM精氨酸，可以观察到更高的峰响应以及单体和聚集体之间更好的分辨率。

△图5 流动相中添加精氨酸对分离的影响

要点2: 流速

在SEC模式下，流速是影响分离的关键因素之一。通常，较低的线速度将获得较高的分辨率：如图6所示，当流速从1.0 mL/min降低到0.6 mL/min，蛋白聚集体、单体和片段峰之间的分离度均得到改善。例如，片段峰峰谷比 (p/v) 从1.66增加到2.40。同时需要注意，流速不可过低，否则会出现柱外体积引起的峰展宽，对分离带来负面影响。

△图6 流速对分离的影响

要点3: 柱外体积

为实现最佳分离，尽量减少柱外体积是另外一个要点，如管路、检测器流通池和接口等连接组件。

常规液相仪器通常适合内径为7.8 mm的SEC色谱柱；采用4.6 mm内径SEC色谱柱时，液相色谱系统柱外体积对分离变得至关重要：通常需要使用内径小于0.13 mm的连接管路和半微量流通池，以确保满意的分离度。

参考文献：

1.Fekete, S.; Beck, A.; Veuthey, J.-L.; Guillarme, D. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 101, 161-173.

2.Goyon, A.; Fekete, S.; Beck, A.; Veuthey, J.-L.; Guillarme, D. Unravelling the mysteries of modern size exclusion chromatography–the way to achieve confident characterization of therapeutic proteins. Journal of Chromatography B, 2018, 1092, 368-3783.

3.Fekete, S.; Guillarme, D.; Sandra, P.; Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Analytical Chemistry, 2016, 88, 480-507.