乳铁蛋白是一种具有多种生理活性的天然蛋白质,参与调节免疫功能、抗微生物、调节铁吸收、促进肠道细胞增殖分化等多种生理过程。
近日,《GB 5009.299-2024 食品安全国家标准 食品中乳铁蛋白的测定》的发布,规定了食品中乳铁蛋白的提取与检测方法,纳谱分析紧随国标要求,推出了适用于样品前处理的SelectCore Heparin肝素亲和柱和适用于液相色谱分析的ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱,本文依照国标方法进行验证,结果均符合国标要求,为食品中乳铁蛋白的检测提供有效地整体解决方案。
适用范围
本方法适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉及乳基婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量的测定。
试剂配制
磷酸盐缓冲液Ⅰ:称取7.1 g磷酸氢二钠、58.4 g氯化钠,加900 mL水溶解,用磷酸调pH至8.0±0.2,加水定容至1000 mL,临用现配。
磷酸盐缓冲液Ⅱ:称取28.4 g磷酸氢二钠,加900 mL水溶解,用磷酸调节pH至7.5±0.2,加水定容至1000 mL,临用现配。
0.1%三氟乙酸溶液:量取1 mL三氟乙酸注入900 mL水中,用水稀释至1000 mL,过0.45 μm滤膜。
样品的制备
2.1 液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)
称取5 g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL离心管中,加入10 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ,涡旋30 s,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取全部上层溶液至25 mL容量瓶中,残渣再分别加5 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ重复提取两次,合并所有上层溶液至25 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,充分混匀后转入离心管中,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间层液体待净化。
2.2 固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品)
称取1 g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL离心管中,加入20 mL温热(温度不超过45 ℃)的磷酸盐缓冲液Ⅱ,涡旋30 s,冷却至室温,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取全部上层溶液至50 mL容量瓶中,残渣再分别加15 mL和10 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ重复提取两次,合并所有上层溶液至50 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,充分混匀后转入离心管中,在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min,吸取中间层液体待净化。
固相萃取法
SelectCore Heparin肝素亲和柱1mL;
活化:肝素亲和柱使用前先加入5.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ活化;
上样:准确移取10.0 mL上述样液过柱,控制流速在1 mL/min~3 mL/min;
淋洗:待样液滴完后,用10.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗,弃去流出液;
洗脱:用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱,收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.0 mL,供上机检测分析用。
注:在样品过柱前,可根据实际样品中乳铁蛋白含量调整具体上样液体积。
柱容量验证
取5.0 mg/mL牛乳铁蛋白标准储备溶液0.40 mL代替样液过肝素亲和柱,按实验步骤3中操作,用液相色谱仪测牛乳铁蛋白的含量,计算其回收率。同一批次至少测试2根肝素亲和柱。
结果判定:牛乳铁蛋白回收率≥95%,为可使用的商品。
液相色谱法
色谱柱: ChromCore 300Ǻ C4-T, 5μm, 4.6×250mm
流动相: A: 0.1%三氟乙酸溶液
B: 乙腈
梯度:
时间(min) | A% | B% |
0 | 85 | 15 |
20 | 15 | 85 |
22 | 85 | 15 |
25 | 85 | 15 |
流速: 1.0 mL/min
柱温: 30 ℃
进样量: 50 μL
检测波长: UV280 nm
由色谱图和加标回收率数据可以看出,纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱可以有效净化待测样品,加标回收率符合国标要求;样品净化后的溶液使用ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱进行分析时,峰型良好并且目标物周围无杂峰干扰。
本文按照国标方法验证了SelectCore Heparin肝素亲和柱的柱容量,柱容量均>95%,满足国标对于柱容量的要求;同时也对ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱进行定量限和标准曲线的验证,定量限为1.0 μg/mL,此浓度与国标标准曲线最低浓度点一致,标准曲线R为0.9995,线性范围为:1.0 μg/mL~ 400.0 μg/mL(相比国标,我们把载量测试的那个浓度点也加进来了)。
Tips:
○柱容量验证时,取5.0 mg/mL牛乳铁蛋白标准储备溶液0.40 mL上样后,可将固相萃取装置上调节阀关闭,使溶液保持2 min后,再打开调节阀,放出溶液;
○样品提取的次数需要多一些,特别是配方奶粉,提取液离心后的残渣还需要提取液多次提取才能提取比较充分;
○纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱采用的是单分散聚甲基丙烯酸酯基质,机械强度高、化学稳定性好,即使小柱流干再次润湿也同样可以保证载量和回收率;
○固相萃取过程中的洗脱步骤需要用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱;
○纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱采用的是可穿透的上盖,如果需要加体积较大的溶液,可以直接在小柱上面加一个12 mL的SPE上样柱即可(如图3所示);
图3 肝素亲和柱搭配SPE上样柱
○首次使用ChromCore 300Ǻ C4-T色谱柱时,可能会出现色谱峰型不对称或响应低的情况,此时需要使用高浓度牛乳铁蛋白对照品(400 μg/mL进样100 μL)对色谱柱进行钝化处理,钝化后将色谱柱冲洗至无牛乳铁蛋白的目标峰后,再进行样品分析;
○因为蛋白在C4分析柱上会有一定残留,建议在做柱容量测试后,空针进样两次把蛋白残留降低后再进行后续测试;
○实验观察到部分聚醚砜材质的滤器对乳铁蛋白大概会有10%左右的吸附,目前测试下来,经过Heparin肝素亲和柱净化后的溶液较为澄清,可以不过膜进样。
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