利巴韦林作为一种广谱强效的抗病毒药物被广泛应用在动物的抗病毒预防和治疗中。但利巴韦林具有一定的遗传、生殖毒性和致癌性,禽畜滥用可能会导致药物残留,其通过食物链进入人体从而影响人体健康。目前常用的利巴韦林的检测方法为《SN/T 4519-2016出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》,本文参照此标准,采用纳谱分析推出的SelectCore PBA固相萃取柱进行前处理,可以有效去除猪肉样品中的杂质干扰且回收率高,另外参考《2019年国家食品安全风险监测检验项目和检验方法》作为液相色谱质谱方法,使用纳谱分析耐纯水的ChromCore AQ C18液相色谱柱,对猪肉中利巴韦林的残留量进行检测,并能够保证利巴韦林和猪肉中的杂质的有效分离。
适用范围
本方法参考SN/T 4519-2016出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法,适用于鸡肉、肝脏、肾、蛋、猪肉、鳗鱼、虾等动物源性食品中利巴韦林残留量的测定和确证。
实验步骤
1、试剂的准备
酸性磷酸酯酶:活力10.4 unit/mg。
酸性磷酸酯酶溶液:取适量酸性磷酸酯酶,用水稀释至0.04 unit/mL的酶解液。
三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8):称取20 g三氯乙酸,加水约950 mL使其溶解,用氨水调pH至4.8(±0.1),再加水定容至1000 mL。
乙酸铵缓冲溶液(2.0 mol/L pH 4.8):称取乙酸铵77.0 g,加水约450 mL使其溶解,用乙酸调pH至4.8(±0.1),再加水定容至500 mL。
乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5):称取乙酸铵9.06 g,加水约450 mL使其溶解,用氨水调pH至8.5(±0.1),再加水定容至500 mL。
10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液:量取10 mL乙腈与90 mL乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5)充分混合均匀。
洗脱液:甲酸-水-甲醇(体积比2:8:90),准确量取2 mL甲酸和8 mL水加入90 mL的甲醇中,混合均匀。
2、样品的制备
2.1 提取
称取5 g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL具螺旋盖的聚丙烯离心管中,添加250 μL利巴韦林-13C5内标标准工作溶液,加入12 mL三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8),和2.5 mL乙腈,振荡提取10 min,6000 rpm离心2 min,取出上清液,下层残渣再加入10 mL三氯乙酸溶液(20 g/L pH 4.8),重复提取一次,合并两次提取液,并定容至25 mL。
2.2 酶解
准确移取5 mL提取液,加入1.0 mL乙酸铵(2.0 mol/L pH 4.8),再加入100 μL酸性磷酸酯酶溶液,加盖后涡旋混合1 min,于恒温烘箱中37 ℃培养2 h。取出后冷却至室温,用氨水调节pH至8.5(±0.1),混匀,6000 rpm离心2 min,取上清液备用。
3、固相萃取方法
活化:SelectCore PBA固相萃取柱100mg/3mL,依次加入3 mL乙腈、3 mL乙腈-1%甲酸水(体积比,3:1)、3 mL乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L pH 8.5)活化,并保持柱体湿润;
上样:加入2.2中全部上清液,弃去流出液;
淋洗:依次用5 mL 10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液、2 mL 5%氨水甲醇淋洗,弃去流出液,真空抽干5 min;
洗脱:加入4 mL洗脱液,收集全部洗脱液至玻璃管中,于50 ℃下氮气至干。准确加入1.0 mL 0.1%甲酸水-甲醇(体积比95:5)溶解残渣,过0.22 μm有机滤膜,供液相色谱-质谱仪测定。
4、液相色谱仪器条件
Column: ChromCore AQ C18,3 μm
Dimension: 3.0×100 mm
Mobile Phase: A)0.2%甲酸水
B)乙腈
Gradient: t(min) A B
0 100 0
2.2 100 0
3.0 95 5
4.0 10 90
5.0 10 90
5.5 100 0
10 100 0
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 35 °C
Injection: 2 μL
5、质谱条件
离子源:电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI)正离子模式
监测方式:多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)
电离模式:ESI
Curtain Gas:40.0 psi
Collision Gas:6 psi
Ion Spray Voltage:5500.0 V
Temperature:500.0 ℃
Ion Source Gas1:50.0 psi
Ion Source Gas2:50.0 psi
Entrance Potential:10.0
Collision Cell Exit Potential:12.0
6、实验谱图
图1 利巴韦林标准品定量离子(10.0 μg/L)XIC图
利巴韦林标准品定性离子(10.0 μg/L)XIC图
图2 利巴韦林-13C5标准品(5.0 μg/L)XIC图
图3 猪肉定量离子(空白样品)XIC图
猪肉定性离子(空白样品)XIC图
图4 猪肉定量离子(加标量:1.0 μg/kg)XIC图
猪肉定性离子(加标量:1.0 μg/kg)XIC图
图5 猪肉定量离子(加标量:10.0 μg/kg)XIC图
猪肉定性离子(加标量:10.0 μg/kg)XIC图
7、加标回收率
加标量 | 平均回收率%(n=2) |
1.0 μg/kg | 90.9% |
10.0 μg/kg | 88.1% |
8、实验结论
样品中的利巴韦林代谢物经酸性磷酸酯酶水解为利巴韦林原药,采用三氯乙酸-乙腈溶液对利巴韦林进行提取,经SelectCore PBA固相萃取柱净化、洗脱液氮气吹干,复溶过滤后上液相色谱/串联质谱仪测定,该方法简便、快速、干扰少,是一种理想的检测方法。同时,本文优化了样品复溶时的溶剂体系,由国标方法中乙腈-水(体积比90:10)优化为0.1%甲酸水-甲醇(体积比95:5),优化后的溶剂体系可极大降低溶剂效应的干扰。由实验图谱和加标回收率数据可得,选择纳谱分析的SelectCore PBA固相萃取柱(100mg/3mL)和ChromCore AQ C18 3μm, 3.0×100mm液相色谱柱,不同加标量的两组实验回收率均高于85%,且目标物质出峰时间快,峰形好,符合国标检测要求。
实验相关产品信息:
产品描述 | 货号 |
SelectCore PBA 100mg/3mL; 50/pkg | PBA050-030100-1 |
ChromCore AQ C18 3μm, 3.0×100mm | A201-030018-03010S |
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