【知识分享】如何增强极性和强极性物质保留能力，这几种方法你值得拥有！

有一个普遍采用的初步探查合适色谱条件的方法：走一下梯度。譬如在一根4.6×150mm，5μm，C18或者C8色谱柱上试着运行20分钟的乙腈水比例变化5-100%的梯度。但这仅对非极性的分析物适合，对酸性和碱性分析物，为了取得重现性好的结果，还必须在水相中加缓冲盐。极性物质很少是中性的，大多数药物分子均属于极性物质，易于离子化。

所以建立一种极性物质的色谱分析条件，最好先走水相是低pH的梯度探查方法。低pH条件可以抑制酸性物质的电离，使分析物处于中性状态更容易在反相色谱中得到保留。一般选用0.1%的三氟醋酸或者0.1%的甲酸溶液替代纯水做梯度就可以。另外一个方案是用10-20mM的磷酸盐调节pH到2.5。

如果这样调节到低pH就已经取得了合适的保留，下一步就只需要优化流动相中水相的比例就可以取得满意的结果。又如果低pH条件不奏效，分析物就可能是处于碱性状态。对于碱性物质，有效抑制离子化的办法是使流动相的pH大于碱性物质pKa2个单位。对有些物质，就要求流动相的pH就要大于9，甚至要11。一般的硅胶色谱柱不能承受，可以选用耐高pH的色谱柱（比如：纳谱分析BR C18）。高pH下，一般选用甘氨酸盐等有机缓冲盐比较合适，磷酸盐在碱性条件下对硅胶基体的损害相对较大。

幸运的话，通过调节pH至合适的酸度或碱度，你就能找到合适的色谱方法来保留强极性物质。如果还不能如愿，就需要另辟蹊径了。

一般载碳量越大，保留能力越强。在反相色谱条件下，即使对极性物质，一般总是C18的保留能力比C8强；不同品牌的色谱柱，虽然同样是C18固定相，但由于硅胶表面键合密度不同，载碳量会有很大的差别。

当你用100%的水或缓冲盐流动相，在耐水、耐碱或耐酸的保留能力已经很强的柱子上仍得不到足够的保留时，离子对方法就是个选择。

所谓的离子对试剂，实质上就是一种表面活性剂，一个带电荷的极性的亲水头部拖着一个非极性的疏水尾巴。当离子对试剂加入到流动相时，试剂的疏水尾巴和疏水的固定相C链通过分子间作用力结合在一起，而把带电荷的头部朝向流动相，这样就使色谱柱同时具有了反相色谱和离子交换色谱的功能了。如果你想保留的是碱性物质，就使用带负电的离子对试剂，如正己基磺酸盐；如果你想保留的是酸，就用带正电的离子对试剂，如四甲基溴化氨。流动相中有机相的比例、离子对试剂性质和加入浓度、流动相温度以及其它一些因素，是影响和调节保留能力的一些主要变量。这个技术，尽管有点复杂且存在潜在的问题，但仍不失为一种保留带电极性分析物的有效手段。

正相色谱通常是分离极性非常强的分析物的最好的方法。和反相色谱主要依靠分析物和固定相之间的非极性疏水相互作用不同，正相色谱分离主要依靠的是极性吸附相互作用。在正相色谱中，极性越强，保留能力越强。裸硅胶、CN、Diol以及氨基键合柱都可用作正相分离。裸硅胶不适合用梯度探查来确定色谱方法，而键合正相柱可以，用异丙醇-正己烷流动相体系，正己烷的比例从高到低变化。

HILIC亲水作用色谱比较特殊，它允许使用的传统的反相溶剂，如乙腈水，但分离模式是正相的，流动相中乙腈的比例提高，保留能力反而增加。

某些特定类型物质的分析，需要专门设计的色谱柱分析。可通过网上搜索或查阅厂商的资料，确定有什么合适的产品适合你现在的应用。有时候只有一家单独的供货商有需要的色谱柱，有时候有些柱子有多个来源。