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【应用分享】无所遁形-青霉素V钾聚合物的测定
文章来源：引自纳谱分析第一届征文活动获奖作品
作者：西南药业股份有限公司 李老师
背景
β-内酰胺类抗生素作为临床中最重要的一类抗菌药物，聚合物类杂质是引发β-内酰胺类抗生素过敏反应的重要过敏性杂质，我司产品目前对β-内酰胺类抗生素聚合物检测均采用中国药典Sephadex G-10的方法，该法分离机理为：由于 Sephadex G-10 的排阻分子量仅为 700d，因此，除部分寡聚物外，内酰胺类抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰。在特定条件下，内酰胺类抗生素由于分子间的氢键、静电相互作用，可以形成缔合物，导致其表观分子量增大，此时在 Sephadex G-10 凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为。利用此原理，在 Sephadex G-10 凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应; 再改变色谱条件，测定样品中高分子杂质和药物分离后的峰响应; 按外标法计算，即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。我司在多批样品的测定实践中，遇到了很多问题，比较头疼的是系统适用性经常达不到要求，导致偏差产生，而经根本原因分析为方法本身问题，因此，选用专属性更好，灵敏度更高的方法具有非常大的现实意义。
SEC方法
体积排阻色谱(SEC)是用来测定大分子和聚合物类分子量分布的重要方法。它是一种不通过分析物与固定相之间吸附作用或分配作用的色谱方法。其原理是根据填料孔隙而分离样品分子，样品大分子不能进入或只能进入部分孔隙，而较小分子则能进入大多数或全部孔隙。
在SEC中，大分子先从柱中洗脱，较小分子后洗脱，而能够进入所有孔隙的最小分子最后从柱中洗脱出来。
纳谱分析BioCore SEC是纳谱分析推出的全新高性能体积排阻色谱柱系列。该产品采用自主创新技术开发的高性能体积排阻分离介质，以孔道结构经过特殊设计的单分散多孔硅胶为基质，在硅胶表面键合中性亲水层以将分析物与固定相之间的相互作用降到最低，广泛地应用于生物制药、医疗、科研等领域。
本次选用纳谱分析BioCore SEC-150色谱柱对青霉素V钾聚合物的含量进行分离和检测。色谱检测条件及谱图如下：
Column: BioCore SEC-150 5μm
Dimension: 7.8×300mm
Mobile phase: 150 mM 磷酸盐缓冲液（pH6.8）/乙腈 =95/5
Flow rate: 0.6 mL/min
Temperature: 25 ℃
Injection: 10 μL
Detection: 268 nm
Sample: 青霉素V钾，流动相配制，浓度为5 mg /mL
Peaks:
因无聚合物对照品，根据分子筛分离原理，主峰前色谱峰均认定为不同聚合度的聚合物。
结论
此次首次采用纳谱分析开发的SEC色谱柱，流动相在色谱柱说明书推荐流动相基础上，加入5%乙腈，即得到较好的分离效果，理论板数由G-10柱的几百提高到现在的两万多，主峰与相邻峰分离度达到1.7，达到基线分离，各聚合物峰峰形较好，且彼此分开，与传统G-10相比，具有无可比拟的优越专属性。
应用相关产品信息，欢迎选购：
产品描述 | 货号 |
BioCore SEC-150 5μm, 7.8×300mm | B213-050015-07830S |
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