【阿拉丁】量子点技术在癌症检测和治疗中的应用

癌症的早期筛查是必要的，因为大多数肿瘤只有当它们含有数百万可能已经转移的细胞、达到一定的大小时才能被检测到。目前采用的诊断技术，如医学成像、组织活检和酶联免疫吸附试验（ELISA）对体液的生物分析所具有的敏感性和特异性不足以检测大多数类型的早期癌症。此外，这些分析是劳动密集型、耗时、昂贵的，且没有能够反复利用结果的能力。另一方面，基于量子点的检测是快速、简单和经济的，可以实现癌症标志物的快速护理点筛查。量子点具有独特的特性，使其成为检测肿瘤的理想选择，包括长时间的强而稳定的荧光、耐光漂白性[1-5]、大的摩尔消光系数、高灵敏度的检测，因为它们具备在吸收和发射光上均非常高效的能力。由于量子点具有较大的表面积体积比，单个量子点可以与多种分子结合，因此量子点在设计更复杂的多功能纳米结构方面具有很大的应用价值。各种类型的生物标记物，如蛋白质，特定的DNA或mRNA序列和循环肿瘤细胞，已经可以从血清样本中确定用于癌症诊断。因此，基于量子点（QD）的多路复用方法[1]可以同时识别多个生物标志物，从而可以实现更有效的癌症诊断。量子点已被共价连接到各种生物分子，如抗体、多肽、核酸和其他配体，用于荧光探测[6-19]。其在生物学中的一些应用[20-32]以及它们在体内分子成像方面的巨大潜力[33-37]正在一一被揭开。

无机量子点相对于有机荧光团的优势

与生物实验中用于荧光标记的传统有机荧光团相比，无机量子点由于其对光漂白的高抗性，使生物材料的可视化时间更长，应用范围更广。由于荧光团对周围环境非常敏感，可以进行光漂白，这是一种不可逆的光氧化过程，使它们成为非荧光体，是所有需要长时间观察荧光团标记结构的研究的主要限制。荧光团只能在很窄的波长范围内被光学激发，荧光发射也被限制在一定的波长范围内。而量子点可以用波长比荧光波长短的单一光源激发。量子点的荧光光谱较窄、对称，在荧光团中没有红尾，各种颜色都可以被观察和区分，没有任何光谱重叠。因此，用不同颜色的量子点对不同结构进行多色标记成为可能。这种多路复用的方法[3, 38-40]在疾病诊断和药物输送等场景中具有广阔的应用前景。

量子点是一个跨学科的研究领域，经过化学、物理、生物和医学等不同学科的人员共同努力，有利于发现它的最大价值，将它们用于癌症的检测和治疗就是一种极为重要的应用。

量子点技术

量子点是一种具有独特发光特性的无机半导体纳米晶体，其典型直径在2-8nm之间。它们通常由元素周期表中的II和VI族元素（例如CdSe和CdTe）或III和V族元素（例如InP和InAs）的原子组成。它们的物理尺寸小于导致量子限制效应的波尔半径[1]激子，这就是它们具有独特的光学和电子特性的原因。

量子点的合成

高质量的量子点已经可以通过各种方法合成[41-43]，但通常它们的合成是在有机溶剂中进行的，如甲苯或氯仿，并且会添加表面活性剂，反应温度较高。但表面活性剂包覆的颗粒不溶于水，其极性表面活性剂头基会附着在量子点（QD）的无机核心上，疏水链则会凸出到有机溶剂中，而一般来说，所有细胞实验都涉及水溶性物质。因此，为了使表面活性剂具有水溶性，人们制定了各种策略，要么替换表面活性剂层，要么涂上额外的保护层，如亲水或两亲聚合物[44-45]。表面活性剂的疏水涂层被配体分子所取代，配体分子一端携带官能团与量子点表面结合，另一端携带亲水性基团使量子点可溶于水。也有报道使用两亲性聚合物作为QD表面的附加涂层[38, 46-48]。聚合物的疏水尾部与QD表面的疏水表面活性剂层发生反应，而聚合物的亲水基团在外端产生水溶性。量子点还被包裹在磷脂胶束[8]中，使其可溶于水。

量子点的性质及应用

最常用的量子点系统是CdSe的内半导体核包覆ZnS的外壳。ZnS壳层负责保障CdSe核的化学和光学稳定性。只需改变量子点的大小，就可以使其发出从紫外线到红外光谱中所有波长的荧光。量子点的荧光波长取决于它的能隙（即激发态和基态之间的差），这是由量子点的大小决定的[49-52]。量子点具有光谱线宽窄、亮度高、宽光谱范围内吸收系数大、高光稳定性和多路探测能力等特点，即使在复杂的体内条件下，它们也非常明亮和稳定，这使它们适用于先进的分子和细胞成像、药物传递以及高灵敏度的生物测定和诊断的应用[53-54]，QD生物偶联物使具有更高分辨率的高灵敏度实时成像，和对活细胞表面单个受体分子的跟踪成为可能[13,55]。量子点的各种应用如图1所示。在大多数情况下，用于癌症检测的功能QD共轭物由半导体核心（CdSe, CdTe）组成；在CdSe作为量子点的情况下，会增加一个额外的壳层，如ZnS，因其具有比CdSe更高的能带隙，能够提高量子产率，同时可作为水溶亲水性涂层，以及作为功能化抗体或其他生物分子在肿瘤位点的补充靶向癌症标记物。

图1. 量子点的应用

克服量子点的毒害性

由半导体纳米粒子组成的天然量子点在自然界中是有毒的。已经观察到，CdSe量子点对暴露在紫外线下较长时间的细胞有很高的毒性，因为紫外线会溶解CdSe，从而释放出有毒的镉离子。然而，在体内研究[48]表明，聚合物涂层量子点在没有紫外线的情况下是无毒的。研究还表明，将胶束包裹的量子点注射到青蛙胚胎中并不影响其发育[8]。因此，量子点通常被封装在两亲性聚合物的外壳涂层内[57-58]，使其具有水溶性，并能抵抗化学或酶降解。它们通常在有机溶剂中合成，如三-正辛基-氧化磷化氢（TOPO）[59-62]和十六烷基胺，它们具有长烷基链和高沸点，从而可以防止形成聚集体。近年来，对量子点进行表面化学修饰使其具有水溶性的研究取得了很大的进展[63-64]。最为常见的是，量子点与聚乙二醇（PEG）或类似的配体连接，以使它们具有生物相容性并减少非特异性结合。通过使用不同的策略将它们与各种生物亲和配体（如多肽、抗体、寡核苷酸等）结合，使它们对目标位点具有特异性。用于检测肿瘤细胞生物标记物的QD生物偶联物的可能示意图如图2所示。图3则简要描述了QD技术用于癌症体内诊断的各个步骤。

图2. 多功能量子点通常用于靶向肿瘤细胞。QDs与各种亲和配体(肽、抗体、抑制剂、药物等)结合，这些配体对肿瘤细胞的生物标志物具有特异性。

图3. 量子点用于癌症体内诊断的步骤。(a)QD生物偶联物的形成，(b)将QD生物偶联物静脉注射到小鼠体内，(c)QD生物偶联物能有效靶向肿瘤细胞。

量子点的闪烁行为

Nirmal等人[65]首次发现，量子点在连续激发下会表现出闪烁行为，即间歇性开关发射，这归因于俄歇电离[65-66]。即使在今天，这种行为的原理也没有得到很好的解释。但是，只有在分析过程中需要单个QD的信号时（如流式细胞术应用程序），它才需要被重点关注到。在这种情况下，单个量子点的发射可能由于“闪烁”而关闭，从而导致探测器的信号丢失。但通常在大多数应用中，如在基于细胞的分析中，涉及多个量子点，即使一些量子点闪烁，其他量子点也会发出信号供最终检测，因此，检测器不会遗漏任何信号。一种抵消闪烁导致的量子产率降低的方法是在量子点核心的顶部组装一个由几层具有更大能带隙的材料原子层组成的壳层。

表面功能化对量子点光学性质的影响

一些基础研究表明，量子点的发光对表面功能化过程非常敏感，因为分子与量子点表面的相互作用会改变量子点表面的电荷[67]，但许多基于量子点的探测应用是基于目标分析物分子与量子点表面功能化的生物分子相互作用后量子点荧光的变化而衍生的。量子点的表面功能化改善了其溶解度，但它也会降低量子效率。这在经巯基乙酸处理的量子点中得到了证明，量子效率大大降低[7, 63]，但是蛋白质功能化的量子点倾向于保持它们的量子效率，并提供更长的保质期，它们还可以在不降低量子效率的情况下被多个官能团[7]进一步功能化。

用于观察和追踪量子点的测量系统

使用共聚焦显微镜、全内反射显微镜或外荧光显微镜可以对单个量子点进行更长时间的观测和追踪，最长可达数小时。Gao等人[68]和So等人[69]介绍了利用量子点作为标签进行荧光成像及其测量的方案：Gao等人采用了波长分辨光谱成像的全身宏观照明系统，可对体内分子靶标进行高灵敏度检测；So等人也采用了波长分辨光谱成像系统，其软件可将自发荧光与量子点信号分离。

主动和被动量子点靶向技术

QD生物偶联物可以通过主动靶向和被动靶向两种机制在体内传递给肿瘤，尽管被动靶向比主动靶向慢得多，效率也低得多。在被动靶向机制中，由于增强的通透性和保留作用，QD生物偶联物优先聚集在肿瘤部位[70-72]。这种效应可以归因于血管生成肿瘤（i）产生血管内皮生长因子，负责增强渗透性，（ii）缺乏有效的淋巴引流系统，这导致QD生物偶联物积累。另一方面，在主动靶向机制中，抗体偶联QD将抗体与肿瘤细胞上存在的前列腺特异性膜抗原等特异性肿瘤生物标记物结合在靶向部位。

深层组织成像要求

研究表明，深层组织成像需要使用远红外线和近红外线[73]，这就需要使用近红外发光的QD来提高肿瘤成像的灵敏度，因为血液和水[74]的主要吸收峰在这一区域不会产生干扰。

去除活细胞中的量子点

在将该技术用于人类的癌症诊断和治疗之前，需要对QD从活体动物体内的清除及其新陈代谢进行更加重点的关注和深入研究，受保护的QD从体内清除的唯一途径是通过肾脏缓慢过滤和排泄，因为通过化学或酶分解的可能性很小。

量子点在疾病诊断和治疗中的潜在应用

基于量子点技术的最新进展和研究人员对此的浓厚兴趣，在不久的将来，量子点在疾病诊断和治疗领域将会有诸多潜在的应用。

生物分子与量子点的结合

目前已开发出各种共价和非共价策略（如图4所示），用于将蛋白质和抗体等生物大分子与量子点结合。生物大分子可以利用交联剂[1, 6, 8, 17, 38, 44, 64, 75-77]进行共价结合，交联剂将量子点表面的-COOH、-NH2或 -SH等官能团与生物大分子上的官能团交联。如今，有各种共轭化学方法可用于修饰生物大分子，使其具有所需的官能团。

图4. 将抗体/蛋白质与量子点连接的各种策略

修饰生物分子的策略

其中一种策略采用N-乙基-N′-（3-二乙基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）作为杂交连接剂，将量子点的羧基与蛋白质的氨基交联。这种方法不需要对蛋白质进行任何化学修饰，因为大多数蛋白质都含有伯胺。

另一种策略是基于活性酯马来酰亚胺介导的胺和巯基偶联。但这种方法有一个局限性，即游离的巯基在氧气存在下不稳定，在原生生物大分子中很少发现。最近，Pellegrino等人[46]采用了含有多个酸酐单元的预活化两亲聚合物将蛋白质与量子点结合。由于聚酐是可生物降解的聚合物，因此这种方法有可能应用于制造持续给药系统，但将生物大分子与量子点精确控制和定向结合的策略尚未被深入研究。Goldman等人[78]利用一种融合蛋白将免疫球蛋白G（IgG）与量子点结合，该融合蛋白具有一个带正电的亮氨酸拉链结构域，可与带负电的量子点发生静电结合，而蛋白G结构域可与IgG的恒定Fc区域结合，从而使F(ab′)2区域可自由用于抗原结合。镍-氮三乙酸（Ni-NTA）作为螯合剂，可用于将六组氨酸标记的生物大分子与量子点结合。Gao和他在美国埃默里大学的研究小组正在开发这种技术，它在生物分子的可控定向结合、探针体积小和生产成本低等方面具有优势。链霉亲和素-生物素结合策略也可用于将生物大分子与量子点结合，因为链霉亲和素涂层的量子点可在市场上买到，而且很容易与生物素化的生物大分子结合[13, 38, 55, 59, 80]。图4展示了量子点的各种生物共轭策略。

量子点对生物分子生物学功能的影响

研究表明，在许多情况下，生物大分子与量子点的共轭不会改变生物大分子与其特定受体的结合能力[6, 8-9, 13, 17, 38, 55, 58-59 64, 76-77, 80-81]及其生物功能。Kloepfer等人[77]发现，将量子点与转铁蛋白共轭不会影响蛋白质的功能。Dahan等人[82] 也观察到，量子点与膜结合受体的结合对受体在膜中的扩散行为没有影响。不过，也有少数报道称量子点可能会影响生物大分子的生物功能，如神经递质血清素与血清素转运蛋白的结合亲和力[14]。这可能是由于量子点的立体阻碍作用，要确认量子点对生物大分子的生物功能可能产生的影响，还需要进行详细的研究。

量子点技术在癌症诊断中的应用进展

在早期阶段，量子点被用于几种成像应用，以取代有机染料，但当观察到这些材料持续发射强荧光数周后，这些材料的巨大应用潜力才得以实现。这是显微成像技术的重大进步，有助于揭示许多细胞过程。在随后的发展阶段，研究人员对量子点技术产生了浓厚的兴趣，并开始探索其在不同领域的应用。制备了由相同材料组成但尺寸不同的量子点，其经单一波长的光激活后可以产生不同的颜色。实验证明，标记有生物分子（如抗体、多肽等）的量子点可用于检测细胞表面或细胞内部的特定分子。

量子点-多肽偶联物可靶向肿瘤细胞

Akerman和同事[58]发表了使用量子点-多肽偶联物在体内靶向肿瘤血管的研究。他们采用了ZnS封装的CdSe量子点，并展示了涂覆有不同多肽的量子点的靶向能力。通过静脉注射后，涂有肺靶向肽的量子点在小鼠肺部聚集，该多肽与肺血管内皮细胞上的膜二肽酶结合；第二种情况是，涂覆有靶向肽的量子点与某些肿瘤的血管和肿瘤细胞结合；第三种情况，涂有靶向肽的量子点会与淋巴管和肿瘤细胞结合。该研究小组还表明，在量子点外涂层中添加PEG可防止其在网状内皮组织中的非选择性聚集。

量子点识别活体乳腺癌细胞的能力

量子点公司（Quantum Dot Corporation）和基因泰克公司（Genentech）的研究小组证明了量子点在识别可能对抗癌药物产生反应的活体乳腺癌细胞方面的潜力[38]。他们采用与免疫球蛋白G（IgG）和链霉亲和素相连的量子点来标记活体乳腺癌细胞表面的Her2癌症标记物，并探索了同时标记细胞表面和细胞核中 Her2的量子点技术。研究人员用单一激发波长同时检测了两个细胞靶标，从而表明不同颜色的量子点（即尺寸不同但材料相同的量子点）可用于区分单个细胞的不同部分，从而实现多重靶标检测。

多功能量子点同时靶向和成像活体动物的肿瘤

Gao和同事报道了多功能量子点同时靶向和成像活体动物的肿瘤的研究[68]。高度稳定的量子点共轭物由两亲性三嵌段共聚物（用于体内保护）、靶向配体（用于肿瘤抗原识别）和多个PEG分子（用于改善生物相容性和循环）组成。通过组织切片显微镜和全动物光谱成像监测量子点探针的体内行为，QD结合物通过静脉注射小鼠，我们观察到它们会通过被动靶向机制（由于肿瘤血管的渗漏）和主动靶向机制（由于包被肿瘤特异性抗体的QD偶联物与肿瘤标记物相互作用）在靶向肿瘤部位聚集。Gao和同事还使用量子点标记培养中的特定细胞，观察到在很短的一段时间内，量子点在细胞核中积累。因此，具有量子点的细胞在注射后，可以借助其荧光在活体动物体内进行跟踪。

近红外量子点用于前哨淋巴结绘图

Kim和团队[34]探索了利用发射波长为850 nm的近红外量子点进行前哨淋巴结绘图的实用性，这是在最靠近受影响器官的淋巴结中检测游离癌细胞的主要途径。将量子点经皮内注射到活体小鼠体内后，甚至在皮肤下1厘米处的前哨淋巴结也能得到实时跟踪。这一进展是一项重大突破，因为在不使用放射性标记的情况下，切除前哨淋巴结所需的切口面积减小了。研究人员正在尝试使用量子点技术来治疗癌症，一种可能性是用X射线/红外光照射注射后的量子点，这将为肿瘤提供热能并引发细胞凋亡/程序性细胞死亡的过程。

用于多路复用的量子点

Goldman和同事[83]在使用单一激发光源的夹心免疫测定中使用了四种具有不同发射波长的量子点，证明了量子点对四种毒素进行多重分析的能力。同样地，Makrides和同事[84]在蛋白质印迹检测中使用了两种光谱不同的量子点来检测两种蛋白质。在需要检测的目标肿瘤部位存在的各种癌症生物标记物时，多路复用的方法具有极其重要的意义。

用于体内成像的自发光量子点

最近，斯坦福大学的Jianghong Rao研究小组证明，自发光QD共轭物（QD-Luc8）具有体内成像的潜在应用价值[69]。该研究小组开发了一种雷尼拉肾形荧光素酶（Luc8）的八次突变变体，它在血清中更稳定，催化效率更高。利用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）盐酸碳二亚胺（EDC）交联剂，将Luc8与聚合物包覆的镉/锌核壳QD 655共轭，制成自发光 QD共轭，它们在没有外部激发的情况下通过生物发光共振能量转移（BRET）发光。BRET是一个能量从发光供体蛋白（如R. reniformis 荧光素酶）向附近的受体荧光蛋白进行非辐射性转移的过程[69, 85-87]，与现有的QD相比，它大大提高了小动物成像的灵敏度。用于体内成像的QD的最大优势之一是，通过调整其尺寸，可在整个近红外光谱范围内调整其发射波长，从而产生在生物缓冲液中高度稳定的光稳定性荧光团。这是因为深层组织光学成像在近红外光谱中效果最佳，因为瑞利散射随波长增加而减少，而且动物体内的主要发色团（即血红蛋白和水）在该光谱中具有局部吸收最小值。使用EDC将检测癌症生物标志物的抗体与QD-Luc8复合物结合。将形成的QD-Luc8抗体复合物通过尾静脉注射到患癌小鼠体内，以检测癌症生物标志物。然后将小鼠麻醉并转移到光密室中。几分钟后，静脉注射Luc8的底物——腔肠素，并拍摄体内生物发光图像。

基于量子点的靶向癌症药物传递系统

Shuming Nie及其同事[35]用一层防水的聚合物涂层改造了原始的镉硒QD，防止了剧毒镉离子从QD共轭物中渗出，并提供了一种将肿瘤靶向分子和给药功能化学附着到QD共轭物上的方法，该研究小组正在开发一种针对癌细胞的给药系统。开发的与肽或抗体结合的 量子点，用于靶向在小鼠体内生长的人类肿瘤细胞，QD将被调整为在红外区域辐射，以防止能量发射对组织造成损害。与针对目标癌细胞表面癌症标志物的特异性肽/抗体结合的量子点只有在受到激光照射时才会释放药物，这样就可以控制接受毒素的细胞，从而将副作用降到最低。同时他们还在努力将量子点的荧光波长扩展到900 nm以上，因为几乎没有任何生物分子的荧光波长超过这一数值。

该技术的现状

如今，在量子点技术的帮助下，癌症研究人员能够观察到肿瘤细胞中发生的基本分子事件。这是通过荧光显微镜在体内跟踪不同大小、不同颜色的QD（标记有多种不同的生物分子）来实现的，量子点技术在纳米生物技术和医疗诊断等领域具有巨大的应用潜力，可被用作标签。但要在人体中使用它们，仍需要进行广泛的研究，以确定使用的长期影响。

量子点在癌症诊断和治疗中的应用前景

研究人员对量子点的探索始于最近二十年。虽然这一领域仍处于起步阶段，但由于其独特的光学和电子特性，它已深深吸引了科学家和工程师的关注。量子点已经彻底改变了分子成像领域，在未来几年，它们将在不同领域得到不同程度的发展，影响最大的领域之一肯定是活细胞的细胞内成像，这项技术将为了解癌症的病理生理学以及肿瘤成像和筛查提供新的见解。量子点在未来肯定会成为所设想的多功能纳米设备的组成部分之一，这种设备可以检测病变组织、提供治疗并实时报告进展情况。

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