细胞内ELISA（也称为基于细胞的ELISA、细胞蛋白质印迹或细胞印迹）是一种使用比色或荧光读数对培养细胞进行定量的广为接受的免疫细胞化学测定方法，用于量化培养细胞中的靶蛋白或靶蛋白的翻译后修饰。

      这里我们提供了96孔微孔板的通用方案。大致流程包括：培养细胞（根据需要进行处理）并将其接种到包被的96孔微孔板中；固定和透化后，将一抗添加到孔中并孵育，然后添加标记的二抗，最后进行检测和分析。

一、准备细胞

      粘附细胞可以在推荐的分析微孔板中生长，或直接接种到分析微孔板中并允许其附着贴壁几个小时或过夜。

所需材料

      - 96孔微孔板：底部透明（荧光抗体需要黑色壁），最好用胺/胶原蛋白等进行包被，以实现最佳细胞培养条件

      - 多通道移液器（推荐）

      - 蒸馏水或去离子水

      - 10×磷酸盐缓冲液（PBS）（80 mM Na2HPO4、14 mM KH2PO4、1.4 M NaCl、27 mM KCl，用NaOH调节p至7.4）

      - 1× PBS：实验开始时准备。将45 mL 10× PBS稀释于405 mL蒸馏水或去离子水中并充分混合。室温保存。

      - 400× Tween-20（20%水溶液）

      - 1×洗涤缓冲液：实验开始时准备。将625 µL 400× Tween-20稀释于250 mL 1× PBS中并混合均匀。室温保存。

实验步骤

1.将细胞以所需密度接种到96孔微孔板中。对于384孔微孔板，以96孔板密度的四分之一进行接种。

      注意：最佳细胞接种密度取决于细胞类型，应根据每个实验确定。例如，在96孔微孔板中，每孔应接种25,000 - 50,000个HeLa细胞。

2.让细胞粘附数小时或过夜。

3.按需要处理附着的细胞，96孔板培养基总体积为100 µL（384孔板体积为96孔板体积的四分之一）。培养基中可接受高达10%的血清。

      注意：您应该确定细胞处理的持续时间。当使用目标药物处理细胞时，我们建议包括未处理的细胞和用药物溶剂处理的细胞。

二、将细胞固定至微孔板

所需材料

      - 10×磷酸盐缓冲液（PBS）：80 mM Na2HPO4、14 mM KH2PO4、1.4 M NaCl、27 mM KCl，用NaOH调节pH至7.4。

      - 20%多聚甲醛

      - 蒸馏水或去离子水

      - 8%多聚甲醛：使用前立即配制。将6.25 mL蒸馏水或去离子水与1.25 mL 10× PBS和5.0 mL 20%多聚甲醛混合。注意：多聚甲醛有毒，应在通风橱中配制和使用。根据当地法规处理多聚甲醛。

      - 实验开始时准备的1× PBS

      - 96孔微孔板。底部透明（荧光抗体需要黑色壁），最好涂层（胺/胶原蛋白）以实现最佳细胞培养

      - 多通道移液器（推荐）

实验步骤

1.立即向含有培养基的孔中加入等体积（100 μL）的8％多聚甲醛溶液。孵育15分钟。

      警告：多聚甲醛有毒，应在通风橱中配制和使用。根据当地法规处理多聚甲醛。

2.轻轻吸出微孔板中的多聚甲醛溶液，并用300 μL 1× PBS每孔清洗微孔板3次。

3.在孔中加入100 μL 1× PBS。用密封件盖住微孔板。

      提示：此时可以将微孔板在4°C下保存几天。如需长期保存，可在PBS中添加0.02%叠氮化钠。

      警告：多聚甲醛和叠氮化钠均有毒，应小心处理并根据当地法规进行处置。

      注意：在检测期间或检测前的任何时候都不应让微孔板干燥。

三、细胞通透

      建议在孵育步骤中使用板振荡器（~300 rpm）。任何涉及去除缓冲液或溶液的步骤之后，都应在纸巾上轻轻叩击培养板以去除孔中的所有溶液。

所需材料

      - 100× Triton X-100（10%水溶液）

      - 1×PBS

      - 1×透化缓冲液：使用前立即配制。将250 µL Triton X-100稀释于24.75 mL 1× PBS中并混匀。

      - 10×封闭缓冲液

      - 2×封闭液：使用前立即配制。将5 mL 10×封闭液稀释于20 mL 1× PBS中。

      - 多通道移液器（推荐）

      - 平板摇床

实验步骤

1.除去PBS，每孔加入200 μL新鲜配制的1×透膜缓冲液。

2.孵育30分钟。

      提示：建议在孵育步骤中使用平板振荡器（~300 rpm）。

      任何涉及去除缓冲液或溶液的步骤之后都应在纸巾上轻轻敲击培养板以去除孔中的所有溶液。

3.除去1×通透缓冲液并向每孔中加入200 μL 2×封闭溶液。

4.孵育2小时。

      注意：建议在孵育步骤中使用平板摇床（~300 rpm）。

      任何涉及去除缓冲液或溶液的步骤之后都应在纸巾上轻轻敲击培养板以去除孔中的所有溶液。

四、一抗孵育

      我们必须至少在一个孔中省略一抗，以确定实验的背景信号，该背景信号可以从所有测量数据中减去。应针对每个实验条件和每个检测抗体执行此操作。

所需材料

      - 细胞内ELISA鉴定的一抗

      - 10×封闭缓冲液

      - 1×PBS

      - 1×孵育缓冲液：使用前立即配制。将2.5 mL 10×封闭液稀释于22.5 mL 1× PBS中。

      - 多通道移液器（推荐）

实验步骤

1.将提供的抗体储备液稀释于1×孵育缓冲液中，配制成1×一抗溶液。

2 .除去2×封闭液，每孔加入100 µL稀释的一抗溶液，4°C孵育过夜。

      提示：为了确定背景信号，请从每个实验条件和所用检测抗体所含细胞的至少一个孔中省略一抗。

五、二抗孵育

所需材料

      - 实验开始时准备的1×洗涤缓冲液

      - 合适的荧光或HRP标记的二抗

      - 10×封闭液

      - 1×PBS

      - 1×孵育缓冲液：使用前立即配制。将 2.5 mL 10×封闭液稀释于 22.5 mL 1× PBS中。

      - 多通道移液器（推荐）

实验步骤

1.按照试剂盒使用说明（或抗体数据表）中的指示，在1×孵育缓冲液中稀释，制备1×二抗溶液。

      注意 ：保护荧光标记抗体免受光照。

2.除去一抗溶液，用250 μL 1×洗涤缓冲液/孔洗涤微孔板3次。

3 .除去1×洗涤缓冲液，每孔加入100 µL 1×二抗溶液，孵育2小时。

4 .弃去二抗溶液，用250 µL 1×洗涤缓冲液/孔洗涤4次。

      注意：不要移除最后一次清洗的缓冲液。

六、检测信号

所需材料

      - 70%乙醇

      - 合适的微孔板读数仪：对于HRP检测，使用能够测量650 nm（最好在动力学模式下）或450 nm吸光度的微孔板读数仪。对于荧光标记抗体，使用相应的成像系统（如LI-COR® Odyssey®或Aerius®的近红外成像系统）。

      - 对于HRP检测，HRP底物溶液

      - 0.5 M盐酸

实验步骤

1.如果使用荧光偶联二抗，请用70%乙醇擦拭微孔板底部和扫描仪表面，然后在LI-COR® Odyssey®系统上扫描微孔板。

      提示：根据制造商的说明使用700 nm和800 nm通道（建议强度范围为 5-7）。

2.对于HRP标记的二抗，移除最后一次清洗液并将微孔板面朝下擦干以去除多余的液体。并添加100 µL HRP底物。

       戳破所有气泡，如下设置微孔板读数仪参数，并记录蓝色变化：

       - 模式：动能

       - 波长：650nm

       - 时间：30分钟

       - 间隔：20秒至1分钟

       - 摇动：读数之间摇动

       - 替代方案：代替动力学读数，在用户定义的时间，记录640 nm处的终点OD，或通过添加100 µL 0.5M HCl来停止反应并记录450 nm处的OD。

3.保存数据并将原始数据导出到Excel。

       提示：使用LI-COR® ICW软件或其他合适的数据分析软件（例如 Microsoft Excel 或 GraphPad Prism）分析数据。

细胞内ELISA的提示和技巧总结：

1.关于细胞

       -细胞接种密度、培养基和其他生长条件是实验成功且可重复的关键。

       -用户应定义特定于细胞类型的参数。

2.细胞附着和固定

      -粘附细胞可以在分析微孔板中直接生长和处理。

      -可以用显微镜检查细胞附着情况。

      -当细胞完全附着时，可以去除培养基并替换为含有处理试剂的培养基。

      -含有高达10%胎儿血清的培养基不会干扰细胞固定和与微板的交联，但可能会干扰处理试剂。

3.细胞处理

      -使用药物（抑制剂或激活剂）时，实验中应同时包括未处理的细胞和仅用药物溶剂处理的细胞。

4.细胞接种密度

      -检测微孔板的细胞接种密度取决于细胞类型。它取决于细胞大小（对于粘附细胞，则为直径）和目标蛋白的丰度。

      -一般建议使用单层以获得稳健的信号。

      -可以通过显微镜观察连续稀释细胞的细胞密度来确定细胞接种的数量。

      -对于粘附细胞，在微孔板（孔尺寸相似）中制备细胞的连续稀释液，并在显微镜下观察细胞密度。在合适的细胞密度范围内，取更大数值的细胞密度将产生更强的整体信号并增加微小信号的检出率。例如，HeLa和HepG2细胞应每孔接种25,000至50,000个细胞，而人类成纤维细胞（HdFN）-每孔接种15,000至 25,000个细胞。

5.对照设置

      至少在一个孔中省略一抗，以便为实验提供背景信号，该背景信号可以从所有测量数据中减去。应针对每个实验条件和每个检测抗体执行此操作。

6.高通量

      该检测也可采用384孔微孔板形式进行，使用四分之一体积的试剂和细胞。

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