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质粒DNA提取实验
2019/11/20 17:18
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方案摘要：
产品配置单：
大肠杆菌检测试剂盒
型号： 96T
产地：
品牌： 远慕
面议
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大肠杆菌显色培养基
型号： 1000ml
产地：
品牌： 远慕
面议
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大肠杆菌检测试剂盒价格
型号： 96T
产地：
品牌： 远慕
¥1
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进口β-半乳糖苷酶（来源于大肠杆菌）9031-11-2
型号： 250U
产地：
品牌： 远慕
¥1
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大肠杆菌成套(新国标)
型号： 4种*4套
产地：
品牌： 远慕
面议
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方案详情：
质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
实验方法原理:
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
实验材料
大肠杆菌
试剂、试剂盒
Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 无水乙醇 LB培养基
仪器、耗材
超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机 电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪
实验步骤:
一、材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：
（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、操作步骤
1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。
2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。
3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。
8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14. 电泳检测提取DNA的质量。
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