细菌基因组DNA提取实验

细菌基因组DNA提取可应用于：（1）获得细菌基因组DNA；（2）作为PCR模板；（3）用于测序、遗传信息分析等。

试验方法原理:

本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术，结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。适合于从1.0x10⁹ 细菌中获得多至20 ug 的基因组DNA。用于PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。

实验材料     

细菌培养物

试剂、试剂盒     

细菌基因组DNA试剂盒

仪器、耗材  

DNA 制备管 小量滤器 离心管

实验步骤

1. 第1次使用时，在Buffer W2 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。

2. 准备Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶中，混合均匀。

3. 4℃预冷Buffer DV。

4. 第1次使用试剂盒时，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml。

5. 第1次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均匀。

6. 准备65℃水浴。

7. 检查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出现沉淀，若出现沉淀，于65℃水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。

8. 将Eluent 或去离子水加热至65℃有利于基因组DNA 的充分洗脱。

三、操作步骤

1. 用2 ml 离心管收集1.0x109（1 ml 菌液OD600 为1-1.5）的细菌培养物，12 000xg 离心30 s，弃尽上清。用150 ul 已加入RNase A 的Buffer S 悬浮沉淀。

* 确认RNase A 已加入Buffer S 中。

* 悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则将影响溶菌效果。

2. 加入20 ul 溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5 min。

3. 加入30 ul 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5 min。

4. 加入450 ul  Buffer G-A,旋涡振荡15 s，65℃水浴10 min。

5. 加入400 ul  Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合，12 000xg 离心2 min。

* 请在实验前按照实验准备步骤2 内容，准备Buffer DV。

6. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12 000xg 离心2 min。

7. 丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2 ml 离心管中）。12 000xg 离心1 min。

* 上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃。

* 如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可过滤除去。

* 有色上相务必除尽，否则将抑制DNA 结合到silica 膜上。

8. 弃滤器，在滤液中加入400 ul Buffer BV，混合均匀。

步骤9-12 可选择离心法或负压法

A. 负压法

9A. 将制备管插到负压装置的插口上，将步骤8 中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，吸尽管中溶液。

10A. 保持负压，加入500 ul Buffer W1，吸尽管中溶液。

11A. 保持负压，沿管壁四周加入700 ul Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 ul BufferW2 洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

* 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于彻底冲洗沾附在管壁上的盐份。

* 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

12A. 将制备管置于一个2 ml 离心管中，12 000xg 离心1 min。

B. 离心法

9B.  将制备管置于2 ml 离心管中，将步骤8 中的混合液移入制备管中，12,000xg 离心1 min。

10B.  弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入500 ul Buffer W1，12 000xg 离心1 min。

11B.  弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入700 ul Buffer W2，12 000xg 离心1 min。

以同样的方法再用700 ul Buffer W2 洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

* 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

12B．弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，12 000xg 离心1 min。

13. 将制备管置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加100-200 ul Eluent 或去离子水，室温静置1 min。12 000xg 离心1 min 洗脱DNA。

* 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。

注意事项     

 Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

试剂盒组成、贮存、稳定性

1.  说明书，耗材：DNA 制备管，小量滤器，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。

2.  RNase A：50 mg/ml，室温保存。

3.  溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml，-20℃密闭贮存。

4.  Buffer S：细菌原生质制备液，加入RNase A 后，4℃密闭贮存。

5.  0.25M EDTA：室温密闭贮存。

6.  Buffer G-A：裂解液，室温密闭贮存。

7.  Buffer G-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。

8.  Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。

9.  Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。

10.  Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。

11.  Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

12.  Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可用百分百乙醇或95%乙醇。

13.  Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。