做病毒浓缩还在用超高速离心法，太 out 了！

慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞，目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
 


慢病毒转染优点：
1.外源基因表达水平较高、表达稳定；
2.转染效率高，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞；
3.慢病毒基因容易操作，易于制备大量病毒且滴度高；
4.病毒基因组可整合到细胞基因组，易于构建稳定细胞株。
 


慢病毒包装技术
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。将外源基因克隆进入表达载体，同时与包装质粒（表达病毒包装所需辅助蛋白）一起转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，收取培养基离心后可直接用于感染宿主细胞，当目的基因进入细胞后被整合到宿主基因组，从而高效表达目的基因。



方法一：超速离心沉淀法
1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。


方法二：依科赛慢病毒浓缩液
1.     收集上清液，3000×g离心15分钟清除细胞和细胞碎片。
2.     将上清液转移至无菌容器中，向4V的病毒上清液中加入1V的病毒浓缩液，4°C 孵育过夜（至少12小时）。
3.     混合液1500×g离心 30分钟，在容器的底部可能会出现为米色或白色沉淀。
4.     吸上清，1500×g离心5分钟，吸液去除所有的残留液体，同时特别注意不要破坏已沉淀的病毒颗粒。
5.     用1/10 -1/100体积冷的，无菌PBS缓冲液或DMEM（含25mM HEPES缓冲液）在4℃条件下重悬病毒沉淀。
6.     分装在预冷的小瓶中，-70℃储存，直到使用。