加、减、换一个载体 的MCS的位点 (给一个表达 载体加、减、换小表达标签,如His6, His10,strep II等,和MCS改造是一样的),其实技术 不是问题,问题在于位点的选择 ,因为载体设计 时应该设计者也考虑过mcs的问题,应该给使用者越多的选择越好,但为什么有的载体只给有限的几个位点呢,一可能是这个载体其他部位本身含有的限制性切点比较多,因而MCS位置的选择比较少,二就是设计者是自用的载体,没有考虑到我们的感受 。
因此如果你要加、减、换MCS,可以按一下几个步骤进行:
1、找到载体全序列 ,查找有没有你想要加的位点(Primer premier5……一堆软件 ,再不济了用word),如果没找到你想加、减、换的位点,恭喜了,要成功了;
2、方法上不太推荐点突变或其他以overlap PCR 为基础的技术,推荐小片段 克隆 ,也就是做shRNA 载体的那种方法,人工合成(按引物 合成)你想要的MCS序列的正反链,两端加上载体上两个切点的粘末端序列,人工退火(95度10min,然后每分钟降5度直至Tm值下5度,维持10min,即可),不用电泳检验,直接按克隆的连接体系将这个小片段与你的载体(相应酶双切)连接转化……
小片段连入的效率相当高,如果大家要检验:在菌长出来后,做PCR检验(人工合成的这个小片段的正链或反链与载体上的引物)。举个例子:
比如要在某载体的EcoR I和BamH I之间加一个新的MCS(EcoR V-Kpn I-Xho I-Hind III)(这几个位点必须在目的 载体上没有,如果有这个切点,你又实在想用的话,可以将目的载体用这个酶单切,绿豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化,再自连——位点封闭):
1、合成 5‘-AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G-3'3'-G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'
EcoR I粘末端 EcoRV Kpn I Xho I Hind III BamH I粘末端 ; (这里面有几个要点,合成时直接合成粘末端,省得再切,这样既省合成的钱,效率又高,如果你需要在改造后的载体继续使用原载体的连入切点,比如上面例子的EcoR I和BamH I,你像例子中一样可以合成完整的酶切位点粘末端,如果你不想使用它们,那就只合成粘末端,比如上面那个例子,应合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……这样连接后,EcoR I切点就被封闭了;再有要注意考虑连入位点之间要留一定的间隔,因为靠着的两个酶是很难双切开的,有时候分步切都没用,因为留给酶结合的空间太小,没法结合l ,一般按照相邻两个酶的推荐保护碱基数中较大的数目留,万无一失啊)
2、退火,如上;
3、克隆,同上;
4、检验,同上。测序,收工。
突变可以考虑,但如果载体太长了,做点突变越不容易,一方面比较难延伸,另一方面,即使延伸了,其他点突变的几率也会比较大,但谁知道呢?有时候要靠一点运气。如果想突变也是可以。
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