第1章 基因克隆1. 操作流程收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体连接，取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴定(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆信息输入数据库——>质粒实物保存2. 方法2.1 设计引物引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCCreverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC2.2 PCR2.2.1 PCR 反应体系模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl4dNTP(10mM) 1.00μl10×PCR Buffer 5.00μlMgCl2(25mM) 5.00μl5’Primer (10-12uM) 4.00μl3’Primer (10-12uM) 4.00μl5M 甜菜碱 10.00μlPfu (5U/ul) 0.50μlddH20 18.50μl第1章 基因克隆总计 50.00μl2.2.2 PCR 反应程序1)从cDNA 文库克隆基因Stage1 Stage2 Stage31 Cycle 30Cycle 1 Cycle95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃2min 30sec 30 secXmin(2min/Kb)10min 1min注：Pfu 酶zui适延伸温度为68℃。2)从含目的基因质粒中克隆Stage1 Stage2 Stage31 Cycle 22Cycle 1 Cycle95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃2min 30sec 30 secXmin(2min/Kb)10min 1min2.3 割胶回收目的片段(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)1) 1%Agarose 胶电泳将目的DNA 片段用干净的手术刀割下，放入1.5ml 离心管2) 称重后，在1.5ml 离心管中加入3 倍胶体积的buffer QG(100mg 加300ul)3) 50℃水浴中放置10min(至胶完全溶解)，每2-3 分钟混匀一次(溶胶液应于buffer QG 颜色相同)4) 加入1 倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻。5) 将样品转移入柱子中(柱子的zui大容量为800uL)，然后13000rpm*1min 离心6) 取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中第1章 基因克隆7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室温放置2-5min，然后13000rpm*1min 离心8) 取下柱子，弃流出液，再次13000rpm*1min 离心9) 将柱子放置在一支新的1.5mL 离心管中，加入50uL EB buffer (或无菌H2O)至膜中央，静置片刻，然后13000rpm*1min 离心，然后测定浓度2.4 连 接在连接反应中通常要求： (目的基因分子数：载体分子数=3：1)连接反应体系sample + -10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μlPGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /T4 连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl于16℃连接过夜。或室温(25℃)1 小时以上。2.5 感受态细胞制备及转化2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、0 )1） 接过夜菌 在15ml 试管中加入3ml LB 培养基，从平板上挑取一单克隆接种，37℃，260rpm，培养过夜，约16 小时。2） 接菌 取2ml 过夜菌接入200ml 新鲜的LB 培养基， 37℃，260rpm，培养，直至OD600=0.4-0.5(一般约2 小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，弃上清。4） CaCl2 悬浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴10min。5）离心 4℃，5000rpm×5min，弃上清。第1章 基因克隆6）CaCl2 悬浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min 即感受态制备完成。此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油，混匀后-80℃冻存，以后使用(一般可存1 个月)。注： 制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。2.5.2 转化(PGEM-T vector)1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。2) 取100ul 感受态细胞，加入5ul 连接液，冰浴45-60min。3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)4) 冰浴2min。5) 加LB 培养基900ul，37℃，150rpm 培养45-60min。6) 4000rpm×3min 离心。7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的LB 板(预先涂布X-gal 和IPTG)。8) 37℃ 培养箱倒置培养过夜，约16 小时。2.6 接菌1） 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是PGEM-T 做连接，经X-gal处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。)2） 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB 培养基。3） 37℃，260rpm 培养。4） 培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR 鉴定。5） 以PCR 结果，将有目的片段插入的样品以5ml LB 培养基再次接菌，37℃，260rpm 培养过夜，约16 小时。2.7 阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定)2.7.1PCR 鉴定体系第1章 基因克隆10X Taq buffer 3 ul4X dNTP (10mM) 0.5 ulTaq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)10uM引物 (双向) 各1ul50%DMSO(which is optional) 1ul模板：过夜菌液 / 挑单克隆 2ul加灭菌水至 30ul2.7.2 PCR 鉴定程序：94℃ 5min94℃ 30s30cycle 55℃ 30s72℃ 3min72℃ 10min4℃ +∞30ul 上样，走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小2.8 质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)2) 弃上清。3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。4) 加200ul Solution II，温和混匀6 次。(此过程不超过5min)5) 加280ul Solution III，温和混匀6 次。6) 以14000 rpm×10 min 离心。7) 取上清，过吸附柱，以10000 rpm×1 min，弃滤液。8) 吸附柱内加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。9) 反复步骤8)一次。第1章 基因克隆10) 14000 rpm×1 min 离心。11) 将吸附柱旋转180 度后再14000 rpm×1 min 离心。12) 加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置2min。13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒DNA。2.9 测 序1) ABI377 测序仪测序。2) 测序结果分析：用软件Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。3. 基因克隆的编码根据实验基因引物的号码相对应编制。如：基因引物编号： 1000_f 1000_r克隆编号： 1000A1 or 100092(注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…zui后一位为克隆数编号，一般为1—3)

获得高纯度核酸通常是实验的第一步，也是非常重要的一步。远慕能为你提供从核酸制备到核酸检测的分子生物学全方位解决方案，准确结果，始于源头。核酸制备第一步：DNA和RNA纯化DNA纯化产品线基因组DNA纯化产品基于硅膜离心柱法从哺乳动物组织/鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、血液/干血斑中纯化高质量基因组DNA。质粒DNA纯化产品基于离子交换技术从大肠杆菌中获得高产、转染级别的质粒DNA。DNA片段纯化产品基于硅膜离心柱法快捷完成PCR产物、限制性内切酶酶切产物、琼脂糖电泳胶块、DNA片段标记或修饰后的产物的纯化，回收率高。DNA纯化明星产品Genopure Plasmid Midi/Maxi Kits两种规格的Genopure质粒纯化试剂盒用于制备高质量质粒DNA，后续适用于转染、测序、限制性酶切、Southern Blotting、PCR、克隆等应用。Genopure Plasmid Midi Kits可以纯化多达100ug浓缩质粒DNA，Genopure Plasmid Maxi Kits可以纯化多达500ug浓缩质粒DNA，适用于后续转染。该产品适用于纯化各种类型和大小的质粒。RNA纯化产品线总RNA纯化产品基于硅膜离心柱法从哺乳动物组织、培养细胞、细菌、酵母、血液、FFPE样本、植物材料中快速简便纯化总RNA，有效防止RNA降解并去除gDNA。mDNA纯化产品从细胞裂解物、组织匀浆、总RNA中高效率分离mRNA。miRNA纯化产品基于硅膜离心柱法从培养细胞、哺乳动物组织、FFPE样本、植物样本等中高效纯化miRNA，同时有效防止RNA降解。RNA纯化明星产品High Pure miRNA Isolation Kit选择不同操作方法可以使用该产品纯化含有miRNA的总RNA或仅富集miRNA。纯化的RNA可以直接用于miRNA阵列杂交、Northern Blotting、基于定量RT-PCR的miRNA相对定量实验。无需使用有害有机试剂，快捷高产，一个产品适用于所有miRNA纯化。核酸制备第二步：全基因组扩增核酸样本不足怎么办？全基因组扩增来帮你！GenomePlex? Whole Genome Amplification (WGA) Kit在核酸制备过程中有时会遇到核酸样本不足的情况，GenomePlex? Whole Genome Amplification (WGA) Kit可以以一个细胞或少量广泛来源DNA（全血、口腔拭子、血卡、植物、土壤及FFPE样本等）为模板进行全基因组扩增且检测不到偏倚。4个小时内即可获得高丰度DNA，适用于下游凝胶电泳、qPCR、CGH微阵列、STR分析、SNP分析等应用。GenomePlex Whole Genome Amplification (WGA) Kit利用了我们的一项专利技术，该技术基于基因组DNA随机片段化的原理，所得的小片段转化为两侧含有通用引物位点的PCR扩增文库分子。WGA通过通用寡核苷酸引物进行的文库分子PCR扩增实现。核酸制备第三步：反转录Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit核酸制备过程中得到的RNA经常会反转录成cDNA，便于操作和保存。高保真反转录系统Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit帮助你实现反转录过程中遗传信息的准确传递。Transcriptor反转录酶是高保真酶，是重组逆转录酶和校正调节酶的混合，可转录较长、稀有、复杂的RNA分子，后续实验可用于转录组测序、qRT-PCR、克隆、全长插入cDNA文库构建、RNA剪切分析等。高度特异和保真：特色逆转录酶使其保真性提高6倍。出色的合成能力：可生成长达14kb的转录子，适用于富含GC的复杂模板。高度灵敏无偏倚：可检测低拷贝模板，RNA使用量可低至10 pg；同时反转录稀有和丰度RNA，不改变基因表达水平。反应更快省时间：RT反应时间可缩短至10min。核酸检测第一步：通用型探针文库（Universal Probe Library，UPL）Taqman的灵敏 + SYBR Green的实惠：UPL通用探针库该探针文库选取各转录组中高频出现的165个8-9个碱基序列，同时在探针合成中采用了LNA技术(Locked Nucleic Acid)大幅度提高了探针的熔点温度，可识别出单个碱基的错配，借助扩增过程中的基因特异性引物的使用，确保了qPCR反应过程中的灵敏度和特异性。准确可靠的实验结果，可广泛应用于基因表达研究分析：165个探针提供超过2,600,000实时PCR的检测分析方法，其中超过50,000种以上为跨内含子区域检测，更可实现对同一基因不同跨内含子方法检测。低成本，高特异性的检测方式：水解探针的特异性，SYBR Green的价格；同一探针配合特异性的基因引物可以实现对多个基因的检测。最少的时间投入，最高的设计效率：30秒钟完成对人类、小鼠、大鼠、果蝇、拟南芥、线虫及灵长类动物的特异性跨内含子定量检测方法的设计，成功率达96％。完整的预制备特异性探针，满足随时实验的需要：无需等待探针合成，大大提高时间利用率。标准化操作流程，适用所有荧光定量PCR机型：无需特殊硬件及使用环境限制，完全开放。核酸检测第二步：终点法PCR终点法PCR明星产品第一个兼具扩增速度与灵敏度的 DNA 聚合酶：KAPA2G FAST DNA聚合酶KAPA2G FAST DNA聚合酶是通过野生型Taq酶改造的第二代工程酶，具有更高的合成能力和合成速度。反应更快：PCR反应时间缩短75%。合成能力更强：延伸时间缩短至1 sec/kb。兼容更广：兼容多种实验样本，甚至富含AT-和GC-的样本。灵敏度及产量更高终点法PCR特色产品1专治各种PCR疑难杂症：KAPA2G ROBUST DNA聚合酶KAPA2G Robust DNA聚合酶通过野生型Taq酶进化改造的第二代工程酶，用于解决广泛扩增子类型（GC-和 AT-rich）的不一致扩增问题。适合于挑战性PCR应用和困难样本的扩增，显著降低使用多种酶和扩增方案的优化难度。强健性：耐受PCR体系中的抑制成分。快速粗提样本中的抑制成分不再困扰PCR反应。样品兼容性广：兼容多种实验样本。优化粗制样本、FFPE样本、富含AT或GC样本PCR反应。延伸速度比野生型Taq酶更快：延伸时间缩短至15-30 sec/Kb，帮助实验者更快的获得结果。灵敏度和产量更高：对于样本量有限或模板含量低的实验尤其适用。终点法PCR特色产品2KAPA小鼠基因型鉴定试剂盒该产品可以在1小时内快速完成小时基因型鉴定，操作简单，灵敏度高。15min快速抽提，KAPA 2G DNA聚合酶45min完成PCR。核酸检测第三步：定量PCR定量PCR明星产品1FastStart通用型qPCR预混液包括SYBR Green染料法预混液和水解探针法预混液，适用于任何进行qPCR的研究人员。2X预混液形式易于使用，在市场上非常受欢迎。预混液中含有dUTP用于避免交叉污染。重复性好，减少非特异性扩增。定量PCR明星产品2KAPA SYBR FAST qPCR Kits第一个含有通过工程化修饰对SYBR Green I染料具有耐受性的DNA聚合酶，尤其适用于高GC含量和低拷贝数的检测样本的基因表达分析。使用快速PCR流程，可以使实验时间缩短55%，仅需40分钟即可完成Real-time PCR反应。核酸检测第四步：一步法RT-PCR/qRT-PCRTranscriptor One-Step RT-PCR Kit提供一步RT-PCR（引物和模板除外）所需的所有组分。优化的反应缓冲液和酶混合物的组合确保了具有二级结构和高GC含量的困难模板的有效转录；Taq DNA聚合酶和校对聚合酶在PCR中提供高产量和保真度。KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits是专门为qRT-PCR反应优化的试剂盒，在灵敏度、特异性、反应效率和荧光值方面都有极佳的表现。试剂盒仅需一步，一个管子，即可以完成RNA的快速定量，操作非常方便，降低污染风险。灵敏度和特异性更高。便于自动化。

    你知道吗？细胞在平面上生长是人为且不自然的，因为这与细胞能够以最佳状态进行旺盛生长的体内环境并不相同。所以，传统的2D单层细胞培养物很难恰当地反映出细胞的体内生长环境，进而可能造成细胞结构和组织功能的缺失。    三维（3D）细胞培养技术能够更好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，其自然条件可保持细胞间相互作用和更逼真的生化和生理反应。在3D环境中，细胞对内源性和外源性刺激（如温度、pH、营养吸收、转运和分化等方面的改变）应答更接近于它们在体内的反应。再生医学的力量为理解发育、老化和组织年轻化等许多有趣的细胞进程提供了方法，了解生物学中这些有趣过程的唯一方法就是研究与生物体非常相似的模型系统，这使得3D细胞培养成为必不可少的研究工具。    3D细胞培养技术使诸多科研工作者从中受益。在过去十年里，研究人员不断开发出更多3D细胞培养系统，从而可以在体外保持细胞的天然3D结构，改善细胞培养环境，辅助它们生长于更接近体内的环境条件中。    那么小编来考考你，目前都有哪些3D细胞培养技术呢？一起来看一下吧！    3D细胞培养技术有很多，但总结起来可分为3类：    第1类：3D水凝胶    基本原理：    水凝胶是水膨胀性的高分子网络，被设计用来模拟复杂的细胞外微环境。水凝胶由水、ECM蛋白和生长因子组成。用于三维细胞培养的第一代水凝胶是从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的ECM聚合物，新一代的合成、混合或基于多肽的材料则可制备满足特定需求的培养环境，为每个细胞和应用需求提供最合适的选择。    技术举例：    1.1 天然水凝胶    ECM凝胶：从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的天然ECM，可提供非常丰富的营养，与细胞的发育具有高度兼容性。ECM的主要组分是层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。这种水凝胶聚合物可通过20-40℃热激活，凝胶化过程也是可逆的（蛋白质浓度：8-12mg/ml）。    MaxGel胞外基质：MaxGel人细胞外基质源于体外培养的细胞基底膜，含有可预测的低水平内源生长因子，更适合需要更明确和特征再造BME的应用，最终可降低实验的可变性。MaxGel人细胞外基质（ECM）含有多种细胞外基质成分，包括胶原蛋白、层粘蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、弹性蛋白以及大量的蛋白聚糖及粘多糖等。用于细胞培养的ECM可以高效地重现上皮细胞与间质在皮肤发育及器官型细胞培养过程中的协同作用。MaxGel可以促进细胞生长和迁移，已被证实可以促进多种类型细胞的增殖，包括神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞。    Cultrex3-D培养工具： 3-D Culture MatrixTM RGF BME低生长因子基底膜抽提物，经过效果验证，专为满足三维培养研究的需求而研制。为了提供最标准化的3D培养基底膜抽提物产品，采用一套特殊工艺来降低生长因子以更好的保证批间一致性，并将基质的标准浓度控制在15 mg/ml左右，随后在三维培养条件下对本品的效能进行评估验证。    在3-D Culture MatrixRGF BME中培养16天后，对MCF-10A细胞进行染色：细胞染色试剂盒（结构）；B）SYBR?Green（细胞核）；C）MitoShift?（线粒体膜电位）；    3-D Culture MatrixRGF BME中培养12天后，对PC-3细胞进行染色：D）Calcein AM（细胞活力）；E）CPA染料1（细胞核）；F）Depsipher?（线粒体膜电位）    天然水凝胶技术优势：    建立已久，支持文献和应用较多    提供天然生物配体    通常含有生长因子和细胞因子    1.2 合成水凝胶    HyStem细胞培养支架——首款定制合成的ECM    HyStem产品是首个可定制的合成ECM，与体内条件非常相近。使用HyStem平台，研究人员可控制生长因子、黏附因子和ECM蛋白的掺入、水凝胶硬度及细胞囊化等。由于HyStem 是一种合成的基质，而不是生物提取物，所以研究人员能够密切控制细胞环境的组成。HyStem的成分包括化学合成的HyStem（巯基化透明质酸）、Extralink?（硫醇反应性交联剂）、脱气的水和生物纯化的Gelin-S?（变性胶原蛋白）干细胞的天然环境富含透明质酸，因此，HyStem试剂盒是培养干细胞的最佳选择。HyStem水凝胶支架精密模仿了天然的细胞外基质环境，含有丰富的透明质酸和胶原纤维，同时具有定制灵活性，能加入适当的生长因子、附着因子和蛋白。    HydroMatrix多肽水凝胶    HydroMatrix水凝胶是一种合成多肽纳米纤维支架，通过高度交联的多肽水性凝胶中的天然三维结构来实现对合成基质的精确控制。HydroMatrix支架可以在温度或离子强度变化刺激下从液态前体自组装为高度交联的三维多肽水性凝胶。通过调整HydroMatrix溶液的浓度，研究人员可以控制3-D结构的柔韧性，并对结构进行剪裁以满足个人需求。HydroMatrix?可以促进细胞生长和迁移，已被证实可以促进多种类型细胞的增殖，包括神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞。    HydroMatrix多肽水凝胶可支持极佳的细胞生长环境。大鼠神经干细胞(NSCs)在3种平面上进行培养：NSCs在组织培养塑料平面生长很差(A)，在多聚赖氨酸/层粘蛋白处理的平面上长势稍好(B)，但在0.5% (w/v)的HydroMatrix多肽水凝胶上表现出极佳的生长状态(C)。    合成水凝胶技术优势：    明确无动物源成分和病原物    无生长因子，无批间差异    可通过额外添加特异的生物相关氨基酸序列实现进一步功能化    第2类：细胞聚集    基本原理：    基于细胞聚集的方法不需要额外添加细胞外基质蛋白，细胞会产生内源的细胞外基质蛋白并不断聚集形成较大的聚集体。由此形成的球体大小和组分取决于起始细胞数量、孵育时间和细胞增殖率等因素。    技术举例：    2.1悬滴培养板    Perfecta3D悬滴培养平板的孔板经过特殊设计，当在小孔上方加入一滴细胞悬液时，孔板的几何构造就会引导细胞和培养基通过一个小洞，进而形成一个稳定的悬滴。滴入口位于每个培养孔的上方，可用来更换培养基，添加外源胞外基质、生长因子、小分子，也可用来加入细胞形成混合培养物。Perfecta3DM悬滴培养板每孔形成一个球体，且可控制球体大小以确保数据的稳定性。 96孔和384孔悬滴培养板与自动化液体处理设备、微孔板读数仪等兼容。    悬滴培养板技术优势：    球体大小和数量可控制，孔间数据可重复    可使用液体处理系统实现自动化    使用较大球体可模拟缺氧状态    提供细胞混合的灵活性，种植前或球体形成后即可    2.2低粘附平面    Corning极低吸附平面是一种共价偶联了水凝胶的亲水不带电平面，以尽可能的降低细胞贴附、蛋白吸收和酶活性，维持细胞以悬浮不贴壁的状态生长。    低粘附培养平面技术优势：    可形成较大的球形体    U型或V型底的96/384孔平板每孔可产生单个球体    2.3 3D PetriDish    MicroTissues 3D 培养皿是不基于支架的天然3D 细胞培养环境，可最大限度模拟细胞间的相互作用和信号交流。该产品线包括多种规格的微组织培养系统，适配标准的12孔和24孔培养板，可应用于形成球状体、乳腺癌细胞球、胶质瘤细胞球、肝细胞球、软骨细胞球、骨细胞球、神经细胞球、心肌细胞球，以及细胞聚集体和拟胚体等多种细胞培养模式。    3D 培养皿制备流程图    3D 培养皿技术优势：    单次移液操作即可获得上百个相同大小的球体    可从单细胞克隆形成球体    可在同一平面对一组球体进行成像    可形成复杂形态的微组织    第3类：培养支架    基本原理：    支架可提供一种物理支撑，细胞可以进入支架生长和行使功能。孔隙分布、暴露平面区域和孔隙度具有关键作用，其数量和分布会影响细胞渗透入支架的效率，而依据不同的制作工艺，支架具有不同的结构、随机或定制的孔隙分布。    支架可以通过包被或功能化以产生不同的特性和影响细胞的生长和行为，且有些“支架”技术还和“水凝胶”技术有着密切的关系。    技术举例：    支架的种类很多，基本可以分为：1. 天然支架如胶原、明胶、纤维蛋白、几丁聚糖、粘多糖、琼脂糖和海藻酸等，天然支架具有生物兼容性，但稳定性较差；2. 合成支架如聚苯乙烯、聚己内酯、聚氨酯等，合成材料具有一致性、稳定性，但惰性、坚硬，生物兼容性较差。    培养支架技术优势：    可实现器官型共培养-模拟分层的组织结构    与现有的塑料制品格式和下游分析方法兼容    结构一致具有可重复性，兼容高通量    小结：不同3D细胞培养技术都各有优势和不足，因此在选择合适的3D细胞培养系统时需要考虑多方面因素，比如要解决的问题或研究目的、实验模型、细胞类型、技术可实现性、下游分析方法和样品数量等。

纯水标准解读实验室纯水可分为4个常规等级：纯水、去离子水、实验室Ⅱ级纯水和超纯水。纯水：纯化水平最低，通常电导率在1-50μs/cm之间。它可经由单一弱碱性阴离子交换树脂、反渗透或单次蒸馏制成。典型的应用包括玻璃器皿的清洗、高压灭菌器、恒温恒湿实验箱和清洗机用水。去离子水：电导率通常在1.0-0.1μs/cm之间。通过采用含强阴离子交换树脂的混床离子交换制成，但它有相对较高的有机物和细菌污染水平，能满足多种需求，如清洗、制备分析标准样、制备试剂和稀释样品等。实验室Ⅱ级纯水：电导率超纯水：这种级别的纯水在电阻率、有机物含量、颗粒和细菌含量方面接近理论上的纯度极限，通过离子交换、RO膜或蒸馏手段预纯化，再经过核子级离子交换精纯化得到超纯水。通常超纯水的电阻率可达18.2MΩ-cm，TOC目前世界上比较通用的纯水标准主要有以下几个：国际标准化组织(ISO)，美国临床病理学会(CAP)试药级用水标准，美国测试和材料实验社团组织(ASTM)，临床试验标准国际委员会(NCCLS)，美国药学会(USP)等。同时，我国也有相应的纯水标准：中国国家电子级超纯水规格GB/T 11446-1997和中国国家实验室用水规格GB/T 6682-2008等。因此市面上绝大多数的纯水系统，无论是进口的还是国产的，都是依据这些标准来设计流程的。 如何选择纯水系统超纯水通常适用于较为灵敏的实验室应用，比如化学分析实验的色谱，质谱，原子吸收，TOC检测，痕量分析等应用。以及生命科学中基因组学，蛋白组学，细胞培养等应用。二级纯水主要应用于缓冲液配制，PH标准溶液，分析和合成用化学试剂配制以及为各种仪器供水等，包括I级超纯水系统，洗瓶机，灭菌器等。三级纯水主要用于微生物培养基的配制以及实验器皿的冲洗。总之，根据自己实验室具体应用以及将来的应用来选择。中国药典规定，纯化水应该严格监测各生产环节，防止微生物污染，确保水质。对于水纯化而言，水源是至关重要的。虽然许多纯水系统的水源要求都是自来水，但各地的水质千差万别，未必都符合条件。如果自来水不符合制造商设定的规格，则可能需要预处理。许多纯水系统都有不同产水量可供选择。产水量高一些显然更划算，不过也不是越高越好。水箱并非保险箱，I级超纯水和II级纯水存放在水箱中水质会快速下降。您需要考虑用水需求的峰值来选择合适的系统，当然也需要未雨绸缪，略微估高一点。

内参抗体可用于评价蛋白质免疫印迹法(Western Blot)的效率，比较凝胶中每孔的蛋白上样量。此类对照可帮助确定样品间表达水平的差异，以判断是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致，还是由上样量的差异导致。内参抗体在目标蛋白的免疫荧光研究中，也可以作为共染的阳性对照。内参抗体分为未标记型和标记型，标记物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Vinculin、Lamin B、PCNA等，其选择常使我们困惑。本文将简单介绍选择内参抗体应遵循的五项原则：一、样本种属来源：首先要考虑实验样本来源于什么物种。1. 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。2. 植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。3. 其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。二、分子量大小：选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小，一般保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。例如，目的蛋白分子量为40KD，此时不适宜选择β-actin、与GAPDH作为内参，可以考虑选择α-Tubulin或者β-tubulin作为内参。三、表达水平：选择的内参蛋白需要在待测样本中是高表达的。常用的内参蛋白是由管家基因高表达的，是细胞发育和维持细胞活力所必须的。例如，细胞核的内参蛋白 PCNA，在 DNA S 期表达，因此对于非增殖细胞不推荐使用。四、表达因素：选择蛋白表达不受实验变量影响的内参。●在做多组织多细胞样本对比表达量时，zui好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；●而在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参；●涉及细胞增殖的相关试验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参；●凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参；●做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin；●做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。

来自劳伦斯利物莫国家实验室的研究者们已经发明了一种新型测试，使用头发中的独特蛋白质标记来鉴别身份。头发蛋白质比DNA稳定得多，也保存得更久，这意味着它不仅可以用作犯罪调查，也可以用作考古研究。人类头发蛋白中秘密“目前，用生物试样鉴别人类身份主要依靠DNA上遗传多态性的描述能力。但不幸的是，DNA会在环境中退化，低于一定水平时，我们就只能用PCR(聚合酶链反应)来扩增。而蛋白质在化学结构上比DNA更加强健，而且可以保留更长时间。蛋白质同样包含有单一氨基酸多态性形式的遗传变异。这些特征可以用来推断不同单核苷酸多态性等位基因的状态，”研究者在发表在PLOS|ONE上的论文中写到。Glendon Parker和同事们在60名欧美人身上(其中10人祖先来自非洲)测试了头发蛋白质作为鉴别标记的有效性，还测试了260年前的6具考古骨骼残骸。他们总共找到了185个头发蛋白标志物。它们所组成的独特模式已经超过从一百万人中区分出一个人所需的量。但是犯罪调查容不得解释或者错误，所以Parker和他的团队希望能识别出约一百个蛋白质标志物的核心集，从而可以在全世界人口中区分出一个人。“目前我们在蛋白质鉴定上所处的位置类似于DNA测试发展早期，”国家实验室法医学中西负责人，研究合著者，化学家Brad Hart说。“这种方法将改变法医鉴定的格局，尽管我们已经取得巨大的进步，但是这些新技术还需要很多步才能释放其全部的潜力。”从发根处可以获取DNA，但并不时常成功。鉴于头发是嫌疑犯在犯罪现场最常留下的证据，头发蛋白质将会给整个执法系统带来变革。

血清是一种纯天然培养基，含有细胞生长繁殖所需的多种营养成分，如蛋白质、多肽等，多用于细胞培养、生物制品及诊断试剂的生产。血清的主要成分是蛋白质，如：白蛋白，球蛋白，纤维粘连素（促进细胞附着）、α2巨球蛋白（抑制胰蛋白酶的作用），激素，胰岛素（可促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，促细胞分裂），类胰岛素生长因子（能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而产生与胰岛素相同的作用），促生长激素（细胞增殖），胎球蛋白（促细胞附着），转铁蛋白（能结合铁离子，减少其毒性）。血清的组成成分与含量常常与供血动物性别、年龄、生理条件和营养条件有关。下面我们来了解一下血清的小知识~如何挑选适合细胞生长的血清？原代或是正常细胞株建议使用BI特级胎牛血清，对生长条件要求高的细胞和干细胞可选用专用特级胎牛血清，或胚胎干细胞专用金牌胎牛血清。由于血清有批间差异，细胞种类不同，我们建议客户购买前可先申请试用样品，通过筛选得到满意的血清批号，之后根据项目需求可进行批量囤货，以保证该项目所需血清质量的一致性，可排除不同批号血清对于实验带来的影响。如何正确保存血清？需要长期保存的血清必须储存于-20℃冰箱（未开封血清有效期为5年）。若存放于4℃，请勿超过1个月，若一次无法用完一瓶，建议将血清无菌分装并冷冻。如何解冻血清？血清解冻需采用逐步解冻法：将血清从-20℃冰箱放入4℃冰箱中溶解一天，然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），减少沉淀生成。切勿直接将血清从-20℃转入37℃解冻，这样因温差较大易造成蛋白质凝结并出现沉淀。需要对新买的血清进行过滤吗？血清在ISO13485认证的厂房中生产，经过3次0.1μm过滤，出厂经过检测并且会使用三种以上的细胞株进行培养测试及无菌检测，污染几率非常低。通常细胞污染有非常多的可能性，根据协助使用者进行分析检测，结果表明绝大部分都是因人为操作失误导致污染。因此买来的血清不需要再次进行过滤。

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    ㈠无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。    ㈡它的优点：    更高的成分限定性    各批产品之间更高的产品质量一致性    简化提纯和下游生产过程    便于控制培养的生理环境    特殊细胞类型的优化配方    ㈢它的种类说明    ⑴UltraCULTURETM培养剂（通用无血清培养基）    产品简介：UltraCULTURE培养剂是一种通用的无血清培养剂。它的组成包括：F-12DMEM培养基，重组人胰岛素，牛转铁蛋白，以及牛血清蛋白的纯化混合物（包括清蛋白）。UltraCULTURE培养基的总蛋白浓度大约为3mg/ml。可在UltraCULTURE培养基中添加防冻剂（Cat.No.12-132）,用于无血清环境下细胞的冻存。UltraCULTURE培养基不含L-谷氨酸，使用前请先加入5ml200mM的L-谷氨酸溶液(Cat.No.17-605或17-905)    适用范围：培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞，疫苗生产中病毒颗粒的制备    存储条件：2℃-8℃    ⑵PC-1TM培养基    产品简介：PC-1培养基是一种低蛋白，无血清培养基。PC-1培养基旨在应用于各种研究和工业用途，使用限定成份配制的培养基确保在维持最低蛋白成分同时使细胞获得最佳的生长状态。    应用：培养原代细胞和贴壁依赖性细胞    存储条件：2℃-8℃    ⑶UltraMEM Reduced Serum培养基    产品简介：UltraMEM Reduced Serum培养基是用于支持多种贴壁信赖性细胞在低血清浓度下的正常生长的限定培养基。在UltraMEM中加入2%的胎牛血清后，其细胞培养效果可与含10%胎牛血清的标准培养基相媲美，有些时候甚至优于标准培养基的培养效果。进一步降低血清浓度（    应用：培养贴壁信赖性细胞    存储条件：2℃-8℃    ⑷X-VIVOTM无血清培养基    X-VIVOTM无血清培养基理念是为细胞提供一个营养成分完全且平衡的环境。它不含任何外源生长因子，人造细胞增殖刺激因子，不明添加剂，任何蛋白激酶C刺激因子。适合于活化的人和鼠淋巴细胞的第二信号系统的研究。    ⑸UltraCHOTM培养基    UltraCHOTM培养基最适于培养转染和未转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞，表达重姐蛋白质。UltraCHOTM培养基以一种改良的DMEM培养基（F-12）为基础，在此基础上添加胰岛素，转铁蛋白以及专利性的纯化蛋白等成分而成。有UltraCHO液体培养基（1X）和干粉培养基（含冷冻添加剂）两种类型的产品可供选择，培养基蛋白含量低于300ug/ml.    应用：培养CHO细胞; 重组蛋白的合成。    ⑹ProCHOTMCDM系统    ProCHO限定培养基系统是专为促进CHO细胞重组蛋白的表达和下游反应而合成的。这种培养方法不需要任何动物来源的成分即可支持高密度的培养。其中的极低水平的重组蛋白有助于下游的纯化和调节。    应用：CHO细胞内重组蛋白的表达    ⑺UltraMDCKTM培养基    UltraMDCKTM培养基是一种无血清限定培养剂，适于高/低平板密度培养MADIN-DABBY犬肾细胞（MDCK）。该培养基只添加了两种蛋白-重组的人胰岛素和牛转铁蛋白，因此蛋白含量极低。经UltraMDCKTM培养基培养的MDCK细胞较在含血清基中培养的细胞显得更小，更密集，而且细胞可在融合状态下生存两周而无须更换培养基。    应用：培养供体外诊断（IVD）用的MDCK细胞。    ⑻Pro293TMCDM系统    用于293细胞（转化的人胚肾细胞）培养Pro293限定培养基系统是专为促进293细胞重组蛋白的合成和下游反应而开发的。这些配方不需要任何动物来源的成分即可支持高密度的培养。其中极底水平的重组蛋白有助于下游的纯化和调节。    应用：293细胞重组蛋白和合成    ⑼Insect-XPRESSTM培养基    Insect-XPRESSTM培养基采用一种无蛋白配方，适合培养来源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆虫细胞系。使用Insect-XPRESSTM培养基可悬浮培养超过8.3*106个细胞/mlSf9细胞。Insect-XPRESSTM培养基    也适用于固定单层贴壁培养和摇瓶培养。Insect-XPRESSTM培养基含有L-谷氨酸.    应用：杆状病毒的增殖，重组蛋白的表达。    (10)HL-1TM完全无血清培养基    HL-1TM完全无血清培养基是一种限定培养基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM完全无血清培养基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。    应用：杂交瘤细胞和淋巴细胞来源的分化细胞的无血清培养。    (11)UltraDOMATM培养基    UltraDOMATM培养基的无血清培养配方适用于中空纤维反应器中进行中，鼠和嵌合杂交瘤细胞的培养及上述细胞的批量培养。该培养基是在RPML1640培养基的基础上添加重组上胰岛素，牛转铁蛋白和牛白蛋白而成。总蛋白浓度是30ug/ml,不含L-谷氨酸。    应用：杂交瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。    (12)UltraDOMA-PFTM无蛋白培养基    UltraDOMA-PFTM无蛋白培养基一种不含蛋白的培养基，适于鼠，人和嵌合细胞来源的杂交瘤细胞系的培养。UltraDOMA-PFTM无蛋白培养基是一种完全限定培养基，不含多肽和组织提取物。UltraDOMA-PFTM无蛋白培养基供实验室和工业生产使用，有液体培养基和干粉培养基。    应用:杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。

4月12日，国药集团中国生物武汉生物制品研究所新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）获批临床试验后，该新型冠状病毒灭活疫苗Ⅰ期临床试验第1阶段入组也在河南启动，本次临床研究为“随机、双盲、安慰剂平行对照Ⅰ/Ⅱ期临床试验”。 研究方为河南省疾病预防控制中心，经志愿者自愿报名，且知情同意后，经多项检测，32名志愿者zui终入组第1阶段临床试验。 在针对新型冠状病毒并无特效治疗药物的背景下，相关疫苗的研发备受关注。xin冠病毒灭活疫苗获得临床试验批件，意味着距离公众迎来疫苗的保护又迈进一步。 中国生物相关人士表示，4月12日，由国药集团中国生物武汉生物制品研究所申报的一类新药——新型冠状病毒灭活疫苗，已经获得国家药品监督管理局临床试验许可。这是全球shou个获得临床试验批件的xin冠病毒灭活疫苗。 该疫苗相关临床试验随之启动。 根据国家相关法律法规规定，已为应急使用做好充分准备。中国生物具备大规模灭活疫苗生产能力，申报xin冠疫苗临床试验批次产量超过5万剂，量产后年产能1亿剂以上。 此前，中国生物曾研发出用于诊断xin冠病毒核酸分子检测试剂盒，以及康复者恢复期血浆技术标准和临床治疗方案。 按照顶层的要求，下一步，中国生物将加快建立以企业为主体、产学研相结合的疫苗研发和产业化体系，加快推进已有的多种技术路线疫苗研发，争取早日推动疫苗的临床试验和上市使用。 早在1月19日，中国生物已经成立由科技部“863”计划疫苗项目shou席科学家杨晓明负责的科研攻关领导小组，安排了10亿研发资金，布局三个研究院所，在两条技术路线上开发xin冠疫苗。 一是灭活疫苗由中国生物武汉生物制品研究所与中国科学院武汉病毒研究所协同攻关，在武汉研发，中国生物北京生物制品研究所与中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所以及中国食品药品检定研究院协作，在北京合作研发。二是基因工程疫苗由中国生物技术研究院牵头推进。 2月1日，中国生物作为牵头单位获得了科技部国家重点研发计划“公共安全风险防控与应急技术装备”重点专项“2019-nCoV灭活疫苗”项目（项目编号为2020YFC0842100）的紧急立项。 xin冠病毒灭活疫苗科研团队自1月起投入研制工作，国家药监局组织技术审评和质量控制方面的专家早期介入且全程参与。 截至目前，中国生物已经攻克疫苗株筛选、毒种库建立、抗体制备及鉴定、检测方法建立、生产工艺研究、配伍及配方筛选等一系列xin冠疫苗的生产和质控关键技术，确定工艺技术路线和产品质量属性，并开展并完成动物体内有效性及安全性评价等工作。 据悉，灭活疫苗是指将通过物理或者化学处理等方法使病毒失去感染性和复制力，但保留了病毒能引起人体免疫应答的活性而制备成的疫苗。灭活疫苗也是针对新发突发传染病zui有效的疫苗研发路径。 同其它类型的疫苗相比（如：基因工程重组疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗与核酸疫苗），灭活疫苗研发技术先进、生产工艺成熟、质量标准可控、保护效果良好。 中国生物已有多个成熟的灭活疫苗研发平台，已经上市并广泛接种的脊髓灰质炎（一类新药）、手足口病（一类新药）、森林脑炎（一类新药）、出血热等多种灭活疫苗，具备大规模疫苗生产经验与能力。此次成功获得临床试验批件，将为xin冠灭活疫苗规模化生产提供可能。

    细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。     质粒已成为目前zui常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。     碱裂解法是一种应用zui为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。     纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、lv仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA,PIAN段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。     一、试剂准备     1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。     2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。     3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。     4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。     5.苯酚/lv仿/异戊醇（25：24：1）     6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）     7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。     8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml     9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。     10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。     11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5靏/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。     二、操作步骤     1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。     2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。     3.将细菌沉淀重悬于100靗预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。     4.加200靗新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。     5.加入150靗预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。     6.加入450靗的苯酚/lv仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。     7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。     8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。     9.沉淀溶于20靗 TE（含RNase A 20靏/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。     三、质粒DNA的电泳检测     观察琼脂凝胶中DNA的zui简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。     取制备的质粒DNA 1-2靗，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。     四、注意事项     本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/lv仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。 

一、核酸的纯化　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。二、核酸的浓缩　　应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。　　具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15－30min，取出目测平衡，0－4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗涤离心2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。 单价阳离子盐溶液贮存液(mol/L)终浓度(mol/L)(醋酸铵*7.52.0－2.5LiCl8.00.8NaCl2.00.2醋酸钠3.0（pH5.2)0.3*：当加醋酸铵时，需加入DNA液的V/2。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。三、DNA、RNA的定量　　准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收，然后，按IA260相当于50μg/ml双链DNA。40μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度，即可大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物（一）琼脂糖凝胶电泳　　可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围浓度%（w/v）分离线状DNA分子的有关范围（Kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2　③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳　　可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度有效分离范围（bp）3.5100-10005.080-5008.060-40012.040-20020.010-100聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度的凝胶。每100ml上述液体加30μl四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温温箱内，以促进聚合。聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染米的迁移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中，标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同标记染料在PAG中的迁移*凝胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯腈蓝3.51004605.0652608.04516012.0207020.01245*这些数字是与染料共同迁移的DNA片段的近似大小（以bp计）。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。（三）分子量参照物　　为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。

细胞培养实验中用量最多的就是细胞培养基，虽然细胞培养试验基本技术大同小异，但是每种细胞的培养条件却相差甚远。若偏离某种细胞所需的培养条件，则会导致细胞表达不同的表型因此，在实验前，需要熟悉自己所使用的细胞系，并在实验中严格遵守所有产品的操作说明。在实验过程中，作为实验小白，我们应该如何应对相关问题呢？首先，我们要如何挑选适合自己细胞生长的培养基呢？选择培养基没有确切的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅ATCC或在购买细胞株时咨询供应商。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。其他实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。也可用多种培养基培养细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验室结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。如何正确地保存培养基？普通的培养基放置在2-8℃冰箱避光保存，若已开封建议3周内使用。未开封的培养基，一般可稳定保存1年。培养基中酚红的作用是什么？导致培养基颜色变化的原因有哪些？酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。培养基颜色变黄，原因有：培养基中细胞代谢产物为酸性，培养瓶受污染，细菌代谢产酸等导致。培养基颜色偏暗红色，原因有：培养基保存在4℃冰箱中，培养基内的二氧化碳逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂酚红会随着碱性增加而更偏暗红。我感觉自己的培养基污染了，这要怎么进行测试呢？取0.1ml液体培养基涂布到无菌蛋白栋牛肉膏培养基上37℃培养24h，观察有无杂菌生长（肉眼即可观察到）。如果我的培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？一旦培养基中添加了血清和抗生素，建议避光保存在4℃冰箱且在2周内用完。因为一些抗生素和血清的基本成分在解冻后就开始降解了。哇！我的培养基怎么有沉淀了，这是怎么回事？怎么预防处理沉淀？首先判断培养基是否已经污染，其次，若沉淀为絮状沉淀则可能是加入血清引起的，此沉淀对细胞培养无影响。若沉淀为结晶，有可能是因为向培养基里加入的辅助试剂降低了培养基的溶解度，使一些无机盐析出。可应用离心、过滤的方法去除这些沉淀，尽可能地减少血清冻融次数。那我什么情况下可以使用不加酚红的培养基呢？研究表明，酚红可以模拟固醇类激素（特别是雌激素）的作用。为避免固醇类反应，培养细胞时，用不加酚红的培养基；一些研究人员在做流式细胞检测时，为了避免酚红干扰检测，也使用不加酚红的培养基。为什么培养基中会含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，它们的作用是什么？L-谷氨酰胺脱掉氨基后可作为培养细胞的能量来源参与蛋白质的合成和核酸代谢。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

  干细胞（stem-cell）即为起源细胞，是指尚未发育成熟的细胞，它具有多分化潜能和自我复制的功能，在特定条件下，可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官。这是继药物治疗和手术治疗后有又一场医疗革命，被称之为医学上的奇迹。  根据其分化潜能不同，可分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。1、全能干细胞：具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞，目前许多研究工作都是以小鼠胚胎干细胞为研究对象展开的，在生产克隆动物、转基因动物、器官移植等方面都有重要意义。国内对于人类胚胎干细胞的研究仍存在很大争议，但观其在临床应用的价值，对于要求开展人类胚胎干细胞研究的呼声也越来越高。2、多能干细胞：即能产生多种类型的细胞但失去了发育成完整个体能力的一类干细胞。如间充质干细胞，其不仅存在于骨髓中，在脂肪、骨骼、肝脏、脊髓、肺以及脐带中都能分离和制备间充质干细胞。间充质干细胞具有能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。神经干细胞存在于神经系统中，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用，但其来源、分离、培养及鉴定还有许多工作要做，神经干细胞诱导、分化及迁移机制也有待进一步研究。3、单能干细胞（也称专能、偏能干细胞） ：此类细胞只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。如肌肉中的成肌细胞又叫肌卫星细胞，当肌纤维（肌细胞）受损后，可通过增殖分化参与肌纤维（肌细胞）的修复。   干细胞研究受到科学家和世人的广泛关注有其必然性，干细胞在生命科学、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景。原代细胞培养尽可能保持体外培养过程中细胞与体内特性一致，使得研究结果更加真实可靠。

无论是国际还是国内环境，ELISA试剂盒市场情况均不容乐观，假货横行混乱不堪，市场产品种类多，商家良莠不齐，为了满足客户希望用很便宜的价格买到“质量好”的试剂盒，作假者使出浑身解数各种手段层出不穷。远慕为您罗列种种陷阱，你中枪了没？科研人士该如何鉴别试剂盒公司卖的是真货还是假货？陷阱一、老师，我们的试剂盒是RD分装，或某品牌的分装.....解读：直接假冒知名品牌，RD等厂商不止一次的发表声明，不会也没有所谓的分装试剂盒由该厂生产；甚至有些指标的试剂盒在RD等官网上根本就查询不到相应产品，作假者会解释为厂商网站更新较慢。陷阱二、包装质量和包装信息，有无厂家名称、电话、地址等信息解读：精致的外包装盒的造价是较贵的；包装信息如有电话，可以拨打进行核实，有条件的最好实地考察。陷阱三、替换指标、真假混卖(常见)解读：用TGFβ来以假乱真，TGFβ是一类在大多数哺乳类动物中广泛表达的物质，其种属间抗原的氨基酸序列同源性很高，部分厂家以此作为万能指标，就能以假乱真。陷阱四、检测指标数解读:如有公司成立时间不长，但可做的指标特别多、又有比较偏门的指标，购买时需谨慎。 陷阱五、检测种属解读：用不同种属的试剂盒替代，由于同一种蛋白有一定同源性，实验结果的准确性可能会差一点。陷阱六、蛋白的真实性解读：生产厂家生产出一个自认为合理的人造蛋白，人造蛋白经免疫后生产出抗体，这个抗体与人造蛋白结合是没问题，但与生物体的天然蛋白结合，就存在一定的不确定性，甚至不能够检测到。而该厂家并不会去验证这种方式生产的抗体是否对天然蛋白有效。如何辨真假方法一、供应商审核1. 从同行或实验室同僚了解供应商的口碑，售前售后的处理情况；2. 查询供应商的网站或与相关人员沟通详细了解相关指标，技术参数（包括板内差异性、板间差异性、批间差异性、重复性、特异性、交叉反应性和回收率等）；3. 了解供应商的研发历史和品牌史，很多供应商频频更换公司名或更换公司注册地，其中的名堂，你懂得；4. 不要迷信国外「品牌」，国外「品牌」不代表是国际知名品牌。根据经费预算，优质国产品牌（远慕是其一）也是不错的选择，因省去不少物流和报关费用，与国外进口试剂盒相比价格上有较大的优惠，而且能提供比较灵活的包装规格，如48T或24T的小包装。方法二、认清订购渠道不论是国际还是国内品牌，都需要在订购前先与制造厂商详细沟通产品细节，了解售前售后技术服务能力等。然后咨询其官方订购渠道，比如直接向厂家订购或通过中国区或省级授权经销商订购。方法三、心理战术给假冒商家所谓研发或技术打个电话，说试剂都是要检测的并且要去实地考察，作假厂商也可能会心虚。方法四、合同签订购买产品时，签订正规的合同，仔细查阅合同条款，如果合同中的汇款账号是个人账号，建议还是让对方提供公司账号为妥。方法五、实验鉴别利用干扰实验即可辨别ELISA试剂盒是否检测目的抗原，方法如下：(1) 将针对试剂盒特异性的重组蛋白抗原和试剂盒中的检测抗体配置成antibody: antigen≈1:2的混合孵育液；(2) 37℃孵育15分钟后，代替原试剂盒中的检测抗体；(3) 后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物；(4) 实验完毕后，检测其标准曲线，如果标准曲线良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配，试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原，该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒；(5) 如果标准曲线无线性，则说明试剂盒检测抗体已被目的抗原中和或干扰，影响了其实际试剂盒抗体的检测作用，则该试剂盒检测抗体针对的是目的抗原。另外，如果购买了两盒同一公司的ELISA试剂盒A和B，可利用交叉实验辨别ELISA试剂盒是否造假。假冒产品所带来的危害不容小视，花了钱是小事，实验数据的可靠性、真实性是大事。对科研者来说，这不仅是浪费了时间、金钱，更为严重的是耽误了毕业、耽误了实验进展和晋升之路。目前来看，科研用检测试剂行业无统一的行业标准，导致少数不良商家浑水摸鱼，甚至横行霸道。远慕作为ELISA试剂盒的专业制造商，是真货，正品，优质的倡导者和拥护者。我们始终贯彻至臻品质，至上服务的理念，希望您不管是刚进入实验室的新手还是已经开展实验的科研人员，面对市面上数以千计的试剂盒，数百家供应商，可以找到最适合且质量又可靠的ELISA试剂盒。此外，在科研人士自我防卫的同时，我们也希望相关部门能够一起净化科研环境，完善法律有段，努力创新，助力科研。科研工作者牢记选择正规渠道！选择优质产品！早发高质量Paper!

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免疫荧光染色是一种常用的一种生物化学检查方法，常用于组织学中抗原或抗体的定位，也可用于体液标本中抗原或抗体的定量检测。许多小伙伴，在做免疫荧光染色实验时，碰到各种各样的问题。事实上，掌握了免疫荧光染色实验的原理、操作步骤及注意事项，要成功完成一项免疫荧光染色实验并不难。1、免疫荧光技术是什么?免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。免疫荧光技术既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。免疫荧光染色实验有两种，包括直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。 免疫荧光法原理图直接免疫荧光法是zui早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。两种方法，基本原理是一样的。免疫荧光 (if) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料（也称为荧光素或荧光物）标记到特异性目标抗原上，所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (fitc) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于if实验中。直接免疫荧光法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想。间接免疫荧光法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。所以间接免疫荧光法geng加常用，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第1抗体的标记显示。2、免疫荧光染色实验操作步骤免疫荧光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤以及测定读数。本文以间接免疫荧光法为例，讲讲从固定到封片每个步骤的原理。1）样品准备(sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、pbs或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用pdl等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mm柠檬酸钠，ph6.0，或1mm edta，ph8.0，或10mm tris, ph10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。2）固定目的是保留组织的原始结构，维持细胞形态和抗原的细胞分布。当组织细胞死亡时，细胞发生分解，从其溶酶体和其他细胞器中释放的酶，可以水解组织，这一过程称为自溶。为了避免这种情况，固定组织细胞很有必要。可以使用适当的固定液固定细胞或切片，固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(p0106)洗涤两次，每次5分钟。常用的固定剂有甲醛，戊二醛，甲醇/丙酮。不同固定剂所需时间和浓度不一，需要根据具体实验进行探索。3）破膜破膜是为了让抗体能与抗原有机会相见。因为免疫染色的基本原理就是让抗原抗体相结合，然后标记的抗体通过发荧光，使得我们可以对目的蛋白进行定性或定量分析。如果要检测的抗原在细胞膜外表面或细胞外基质，那么可以省去破膜步骤。因为在不破膜的情况下，抗体也能有机会与抗原结合。但是，如果需要检测的抗原在细胞内，则需要破膜，将细胞暴露于针对目的蛋白的第1抗体，以确保抗体可进入表位。常用的破膜剂有triton x-100, np-40, brij-58, 皂苷, 洋地黄皂苷, 甲醇/丙酮。同样，应根据具体实验进行破膜剂的选择。4）封闭(blocking)封闭是使一抗的非特异性结合zui小化的重要步骤。在使用特异性的一抗与目的蛋白结合的过程中，如果有非特异性结合，则可能出现假阳性结果，较强的背景染色也会干扰目的染色的呈现，影响实验结果的判断。从理论上讲，任何不结合靶抗原的蛋白质都可以用于封闭。血清是一种常见的封闭剂，因为它含有与非特异性位点结合的抗体。用血清或蛋白质封闭剂封闭可防止抗体与组织或fc受体非特异性结合。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。5）一抗孵育(primary antibody incubation)事先选择的特异性一抗可以与目的蛋白结合。这一步需要注意的是一抗是抗什么物种的。如果组织细胞来源是小鼠，则一抗应该是某种动物抗小鼠，这里的某种动物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。6）二抗孵育(secondary antibody inucubation)第1抗体孵育后，洗掉未结合的一抗抗体，便可以进行一抗与二抗的结合。二抗应该是针对第1抗体宿主物种的，荧光标记的第二抗体。例如，一抗是羊抗小鼠，二抗应该是某种动物抗羊，比如兔抗羊。如果进行的是双染，就要注意一抗二抗宿主的选择，不要使其有交叉结合的可能。比如，组织来源是小鼠，有两个目的蛋白需要检测，一抗宿主应该要不一样，二抗应有不同荧光标记。针对a目的蛋白的一抗是羊抗小鼠，针对b目的蛋白的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和羊是不同一抗宿主），a二抗是带有绿色荧光的兔抗羊二抗，b二抗是带有红色荧光的兔抗大鼠二抗，这种搭配是可以的。在荧光显微镜下，a目的蛋白染成了绿色，b目的蛋白则染成了红色。但是，如果b一抗也是羊抗小鼠，则a二抗也会与b一抗结合，这时候就乱了，荧光镜下一片绿。7）封片封片是指免疫染色后，使用固定介质将盖玻片粘附到组织切片或细胞涂片上。封片可以保护已染色的标本，以免受到物理损害。进行封片的固定介质也有助于提高显微镜下图像的清晰度和对比度。8）蛋白检测(detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。 3、三种细胞免疫荧光染色实验操作举例zo-1的免疫荧光1）细胞在盖片上生长融合到95%-时，从孵箱中取出。2） 用预温的1×pbs洗3次，每次10分钟3）4%的甲醛室温固定20-30分钟4）1×pbs洗3次，每次10分钟5） 0.2%triton x-100透化2-5分钟6）1×pbs洗3次，每次10分钟7. 5%bsa室温封闭30分钟8） 加一抗(用1%bsa稀释)放在湿盒里，4度过夜9）1×pbs洗3次，每次10分10）加二抗（用1%bsa稀释）30分钟，闭光！!！11）1×pbs洗3次，每次10分钟12） 95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%triton，5%bsa均用1×pbs稀释"细胞爬片的免疫荧光1）取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里，pbs洗三遍。有的时候作的细胞爬片可能比较小，夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加pbs不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加pbs，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2） 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，pbs洗三遍。3）0.2%triton x-100通透10分钟，pbs洗三遍。4） 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，pbs洗三遍。5）一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果hao，pbs洗三遍。6）二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，pbs洗三遍。7）zui好用dapi染核，然后直接照荧光片。8）蒸馏水洗掉pbs，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。细胞免疫荧光简单实验1）漂洗血清蛋白h7.2-7.4 37度 pbs 2小时.2）-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3）pbs洗净:3min*34）1%triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpbs5）pbs洗净:2*5min6）羊血清封闭：37度，20分钟7）一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时8） 4度pbs洗净，3min*5次9）二抗37度小于一小时10） 37度pbs洗净，3*5min凉干封片(封闭液ph8.5)不管采用何种方法，在使用pbs缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下ph值，可以使用pbs多清洗几次，也可以延长pbs清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。4、免疫荧光染色操作注意事项1）荧光试剂要放好尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光，则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。因此，荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。2）选择荧光要谨慎免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，如今流式细胞仪能检测每个细胞中20多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如zui大吸收波长和zui大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。3）合适对照不可少任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。每次试验时 ，需设置以下三种对照：（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3） 荧光标记物对照：pbs+荧光标记物5、免疫荧光实验常见问题排除指南1）背景染色太强背景染色太强是指除了我们想看到的特异性染色在前台唱主角演戏，还有一堆吃瓜群众（与想看到的特异性染色颜色相同）在后面抢戏。是什么原因导致这些戏精抢了主角的戏呢？可能的原因如下。组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间二抗有非特异性结合：要想验证是否如此，可以在染色过程中做个只加二抗的空白对照（也就是说不用特异性的一抗进行一抗的孵育过程，比如用一抗稀释液进行孵育一抗的步骤）. 如果空白对照有染色，说明二抗有非特异性结合，这时候建议geng换一种二抗。自体荧光:想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的pbs洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。抗体浓度太高：降低所使用的抗体浓度或调整孵育时间。洗涤不充分:染色有很多步骤，其中又包括很多洗涤的步骤。在实验过程中，确保洗涤到位，不要偷工减料。2）染色较弱或没有染色可能的原因如下：组织本身不存在你想研究的目的蛋白或者表达量很少。如果怀疑目的蛋白并不存在，可以通过多种方式验证，比如wb。因为不同探究蛋白的实验的原理和操作会不一样，所以可能得到的结果会不一样，多种实验的验证geng有可能避免假阴性的出现。如果目的蛋白表达量很少，则可以考虑增加一个扩大荧光信号的步骤。荧光显微镜的问题。如果对荧光显微镜的参数设置不对，有可能导致看不到荧光。比如光源/滤光设备与你想检测的荧光不匹配。每次拍照，记得检查参数是否有误。曝光时间太短或吸光太少（gain值太低）:可以尝试调大gain值并/或增加曝光时间，找到zui佳值。曝光时间太长，出现荧光淬灭：避免让切片过度曝光。使用完立即将切片保存在黑暗处。细胞/组织固定过度：因为过度固定可以让抗原表位带上面具，使得抗体无法与抗原结合，这样当然就没啥荧光啦。所以可以尝试减少固定的时间，也可以尝试做抗原修复以显现抗原表位。组织/细胞干透:确保整个染色过程中，切片都处于潮湿环境。细胞没有通透，一抗进不去:举例来说，如果你想研究的目的蛋白在细胞里面，但是抗体因为没有金刚钻，不能进入细胞里与目的蛋白长相厮守，那么你当然看不到它们的爱情闪光点。所以呢，可以想办法让细胞开通绿色通道，搭个鹊桥。比如，如果使用甲醛固定组织细胞，可以用0.2% triton x-100（不同实验可能所需浓度不一）通透细胞。如果是用甲醇或者丙酮固定的组织细胞，则不需要使用triton x-100，因为前者可以通透细胞。一抗量不够/孵育时间太短:提高抗体的浓度或增加孵育时间一抗不合适：购买一抗前，记得阅读产品信息，不是所有一抗都可以进行免疫荧光染色实验的。另外，确保产品没有过期。一抗二抗不兼容：举例来说，如果你的组织来源是小鼠，那么一抗应该是某种动物抗小鼠，比如山羊抗小鼠，那么，此时二抗应该是某种动物抗山羊，比如兔抗山羊。也就是说，二抗应该是抗一抗宿主的。切片储存时间过长：样品染色后应该尽快观察拍照，否则信号会随时间减弱。可以考虑将切片保存在 4?c 避光处，尽量延长储存时间。抗体储存问题：避免反复冻融抗体，因为可能会引起抗体出现降解。建议买了抗体后，根据实验每次的需求，将抗体分成多个小份保存，这样每次使用一个小管即可。另外，储存前记得看说明书，根据说明书的指示进行保存。比如具体保存温度，是否要避光等。小结：希望上面这些小贴士，能帮助大家成功完成免疫荧光染色实验

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由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中zui普遍的试剂的基础。目前血清采集地主要分布在以下国家：市面上的牛血清产品名称虽然五花八门，但根据其不同的特性，追其根本，大致可分为以下四种。根据牛的取血年龄可以区分：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。国产胎牛血清（并无明确定义，但通常用此命名）指的是出生4-6小时，且未进行哺乳（unsuckled）进食的新生牛，有时还称作国产新生牛血清。新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS，或称小牛血清）指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。几种血清的比较：这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。常规来说，年龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。胎牛血清培养效果好于新生牛，且因为胎牛未进食过母乳，所以IgG含量低。故目前多数实验人员选择的都是胎牛血清进行细胞培养。胎牛血清根据实验要求的不同又进行了特殊加工工艺加工，那么在这么多种类的血清面前，要怎么选择适合自己细胞培养的那一款呢？★ 我们需要知道都有哪些种类的牛血清和它们的用途：1、透析血清分子量小于10,000的分子如氨基酸、葡萄糖、盐离子和未结合的蛋白均被移除。透析血清主要用在进行营养成分优化和标定特定成分进行研究的实验中。2、碳吸附血清使用活性和右旋糖苷去除血清中的亲脂类(lipophilic)物质，如某些激素、细胞因子、生长因子等，去除作用对分子量大小并无区分。碳吸附胎牛血清常用于体外培养研究验证激素的作用效果。3、去外泌体血清适用于收集细胞分泌的外泌体时使用。4、低IgG血清用于研究抗体、病毒和病毒反应、细胞表面抗原表位。5、四环素血清应用于使用敏感四环素诱导表达系统的细胞培养(Tet-on, Tet-off)，以及其它对四环素敏感的实验中。6 、IR (辐照)钴60伽马辐照剂量在3.5Mrad. 通过直接与间接作用将生物大分子（如核酸）键结破坏，人畜用药物/疫苗，及对微生物负荷(Bioburden)要求zui高水平的实验。7、HI (热灭活)处理血清56℃, 30Min, 破坏补体，确保细胞与抗体结合不会发生裂解。8、胚胎干细胞（ES）专用血清是从多个批次的胎牛血清筛选出特定批号，适用于人及小鼠胚胎干细胞、成体干细胞及原代细胞长期培养。9、间充质干细胞（MSC）专用血清从多个批次的胎牛血清筛选出特定批号，经过骨髓，脂肪组织及脐带来源的间充质干细胞的细胞活性严格测试，通过传代及分化比例测试。其他动物血清10、马血清10%马血清可代替FBS用于支持SRBC的体外抗体应答, 常与牛血清结合或单独作为哺乳动物细胞培养的补充培养基。11、猪血清猪血清在染色体研究中表现非常出色，可用于淋巴细胞培养, 疫苗生产（生产支原体）, 中和脂质体包裹的腺相关病毒（AAV）, 用于诱导大鼠肝纤维化, 作为酶联免疫吸附试验（ELISA）中的标准阴性参考。12、兔血清正常兔血清可作为免疫分析的阻断剂和对照。在免疫组织化学和免疫细胞化学方面，各种研究均采用20%或1:200稀释兔血清作为阻断剂。13、羊血清    用于生物医学研究的大多数细胞系和原代培养物上，FBS的合适替代物，病毒分离和鉴定，病毒学研究。    用作鱼类细胞培养的有效NBCS替代物。    可成功地代替胎牛血清在生长培养基中长期用于环孢蘑菇的体外繁殖。胎牛血清成分已知的已有上千多种，以下为主要成分表：各位老师可以根据自己的实验需求选择不同的血清。★ 我们同时为您收集了一些使用血清时的典型问题：01、血清的颜色如何？为何有的胎牛血清颜色偏红，而有的偏黄？是因为胎牛血清颜色是由血红蛋白（鲜红）和胆红素（黄）决定的，主要是受血红蛋白影响。血红蛋白含量很低时，含少量胆红素，呈淡黄或金黄。血红蛋白含量高时，会呈现淡红色。需要长期保存的血清必须储存于-20℃冰箱（未开封血清有效期为5年）。若存放于4℃，请勿超过1个月，若一次无法用完一瓶，建议将血清无菌分装并冷冻。02、血清如何解冻，使用前是否需要过滤？血清解冻需采用逐步解冻法：将血清从-20℃冰箱放入4℃冰箱中溶解一天，然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），减少沉淀生成。切勿直接将血清从-20℃转入37℃解冻，这样因温差较大易造成蛋白质凝结并出现沉淀。本公司血清在ISO13485认证的厂房中生产，经过3次0.1μm过滤，出厂经过检测并且会使用三种以上的细胞株进行培养测试及无菌检测，污染几率非常非常非常（重要的事情说三遍）低。通常细胞污染有非常多的可能性，根据协助使用者进行分析检测，结果表明绝大部分都是因人为操作失误导致污染。因此买来的血清不需要再次进行过滤。下图为ren肉眼和光学显微镜所能观察到的微粒大小。由于我们的血清是经过3次0.1μm过滤，因此若肉眼可以观察到异物时，可以考虑：    是否血清溶解后蛋白质凝集    是否操作时导入污染物03、为什么血清中会有沉淀生成，主要成分是什么，会对实验有什么影响？血清中沉淀主要有：纤维蛋白（絮状沉淀），胎球蛋白[1]，脂蛋白，冷凝集素，玻连蛋白，磷酸钙（显微镜下小黑点沉淀），胆固醇等。原因：造成沉淀的主要原因是温度的改变。热灭活，反复冻融，长期储存于2-8℃或者室温。预防：非必要，不用热灭活；避免反复冻融；-20℃保存；4℃全融（期间间断摇晃均匀）；2000rpm离心5分钟(不建议用0.2um滤膜过滤） ，取上清使用。04、黑胶虫是来源于血清吗？目前科学界对黑胶虫的身份并无定论, 通常是显微镜下观察到密密麻麻的小黑点在培养基中自主游动，就称为黑胶虫污染。黑胶虫在镜下的典型特征呈卵圆状、球状、杆状等，可引起细胞生长迟缓或裂解凋亡。目前没有充分的数据表明黑胶虫来源于血清，因为其尺寸远大于血清过滤时所用的0.1微米(μm)滤膜。远慕生物小编建议各位老师通过使用三抗（Cat#: 03-032-1B）外加支原体处理试剂（Cat#: 03-038-1B）尝试杀灭黑胶虫。05、血清存在批间差吗？因为血清来源于动物，其组成成分有1000种左右，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生li条件和营养条件不同而异。每个批号的组分和百分比含量都是不固定的，所以批间差异是存在的。建议先进行批号测试，筛选出合适批号，购买半年甚至一年以上的用量，避免批间差造成实验波动（胎牛血清在-20℃保存可达5年）。

韩国《朝鲜日报》4月2日报道称，UV（紫外线）LED解决方案企业——首尔伟傲世2日委托韩国高丽大学研究组进行了一项实验，实验结果显示，使用Violeds光照射30秒，杀灭了99.9%的新冠病毒。Violeds是一项使用紫外线LED（发光二极管）对事物进行照射，或者在空气净化系统上安装LED芯片，从而杀灭细菌等有害菌的杀菌技术。报道称，病毒靠近Violeds光源越近，暴露时间越长，灭菌效果越佳。首尔伟傲世系首尔半导体公司的子公司，伟傲世正同分公司美国SETi批量生产Violeds。此前，Violeds被证实能够对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎球菌等起到99.9%的灭菌效果，此次试验又证实了它可以杀灭新冠病毒。首尔伟傲世方面表示，期待Violeds技术能够在空气净化器或冰箱等各种家用电器上得到应用。该公司有关人士表示：“该技术将为韩国乃至欧洲和美国等地的新冠防疫工作做出贡献。”大连化物所研发新材料，新冠病毒吸附灭活率达96.5%至99.9%安徽省疾病预防控制中心进行的病毒灭活实验结果表明，该材料具有直接吸附灭活新冠病毒作用，灭活效率达96.5%至99.9%。在实验环境中，新冠病毒浓度为5微克/毫升，远高于实际场景中的致病浓度。此类固体催化材料无毒，不溶于水及有机溶剂，可制成颗粒或担载于各种载体上，有望广泛应用于抗疫产品及日常空气和水净化用品上，实现对病毒吸附灭活。早在2003年SARS病毒肆虐期间，大连化物所就提出利用吸附和催化原理灭活SARS病毒设想，联合大连医科大学病毒实验室组成联合攻关团队；按催化剂设计理念快速合成100多种无机多孔固体材料，从中选择典型样品，经多次副流感病毒灭活实验验证后，送交军事医学科学院进行SARS病毒灭活实验，证实所选材料具有直接吸附和灭活SARS病毒作用。经大连医科大学检测，该类材料对人腺病毒Ⅰ型、Ⅴ型和人疱疹病毒Ⅰ型等也有明显抑制作用。相关工作发表在《催化学报》《色谱》及《中国病毒学》等杂志。虽然该项研究达到预期目标，但正逢SARS疫情迅速结束时，因此并没真正发挥作用。新冠病毒爆发后，大连化物所在第一时间重启17年前的工作，升级技术手段，重点对催化材料批量制备技术和材料吸附灭活病毒性能与机理开展研究。目前已完成单批次百公斤以上催化材料生产，具备吨级以上生产能力。研究团队还基于空气净化、人身防护等开展催化材料应用研究，完成蜂窝状、金属网状及无纺布等载体担载及成型技术与工艺开发，为实现该材料在空气过滤与净化、口罩等产品的应用打下基础。不用疫苗也能预防新冠病毒感染吗？过去几周，《细胞》杂志以“提前公开”的形式，陆续发表了多篇关于新冠病毒的重要论文。今日，又有一篇论文以同样的形式上线。在这篇论文里，一支跨国研究团队提出了一种预防新冠病毒感染的新思路。在缺乏有效治疗药物和预防疫苗的当下，这项研究的重要性不言而喻作者们在论文中指出，先前的多项研究均暗示ACE2在新冠病毒引起的疾病里，扮演了重要而复杂的角色。一方面，ACE2是新冠病毒进入细胞所识别的受体。在小鼠模型里，ACE2表达水平越高，疾病就会越严重；另一方面，ACE2还有一定的保护作用。如果ACE2表达水平很低，小鼠的肺部损伤就会更严重。这些观察让研究人员们产生了一个大胆的想法——使用体外纯化的重组人类ACE2蛋白，能不能预防新冠病毒的感染？这背后的逻辑很简单：新冠病毒会识别并结合人类ACE2蛋白。从外部加入的这些蛋白就像磁铁一样，会把新冠病毒给“吸走”，让它们无法入侵细胞。这样一来，我们不就能削弱病毒的人体感染力了吗？为了检验这个想法，研究人员们先是分离出了新冠病毒，再用它们去感染培养的细胞。有意思的是，如果病毒在感染细胞之前，先和重组人类ACE2蛋白接触30分钟，这些病毒的感染能力就会明显削弱。研究人员估计，削弱的幅度大约为1000-5000倍。相反，如果加入的是新冠病毒无法特异结合的鼠类ACE2蛋白，就无法起到抑制新冠病毒感染的效果。在细胞实验取得积极成果之后，研究人员们在“类器官”模型里做了后续的研究。相较细胞模型，类器官能更好地反映器官的一些关键特征，从而具有更好的代表意义。利用诱导多能干细胞技术，研究人员们得到了人类毛细血管和肾脏的类器官，并确认病毒会在其中进行复制。和先前细胞实验结果类似，加入重组的人类ACE2蛋白，均可显著减少新冠病毒的感染。在肾脏模型中，这种抑制能力还表现出了剂量相关性——加入的ACE2蛋白浓度越高，抑制能力就越好。而安全性的初步数据也表明，无论是毛细血管模型还是肾脏模型，体外加入的ACE2蛋白，都没有产生毒性。在讨论环节，科学家们也指出该研究存在多个局限性。首先，这项研究针对的是病毒的早期感染阶段，目标是防止新冠病毒早期入侵宿主细胞。人类重组ACE2蛋白在病程后期是否还有抑制效果，是一个未知数；其次，本研究选取的毛细血管和肾脏类器官虽然在病理上有一定科学依据，但研究人员们并没有测试肺部类器官，而这是新冠病毒感染的重灾区；最后，在实际的生理环境下，ACE2相关的信号通路和调控网络更为复杂。我们还需要进行更多研究，才能知道额外添加的人类重组ACE2蛋白可能会产生哪些效果。总结来看，作者们在论文里指出，这些结果表明可溶性的ACE2有望抑制新冠病毒，防止它们进入细胞。在各种“老药新用”迟迟得不到临床验证，疫苗又需要12-18个月才能诞生的当下，这项研究无疑带来了一种预防病毒感染的新思路。当然，仅凭这些细胞实验和类器官实验的结果，是远远不够的。为了验证它的预防潜力，我们还需要进行更多的探索。有意思的是，出于其他一些目的，纯化的人类重组ACE2蛋白在过去已经完成了1期和2期临床试验。这是一个良好的开端，我们也希望科学家们后续探索的时间不用太久。

细胞内的各种分子是怎样运输传递不同的细胞器和结构中的？马达蛋白是如何区分“谁”该运输“什么货物”“到哪里去”？这是生命活动一个未解之谜。新的研究方法为传统观点带来了不同的新见解。细胞内有各种细胞器和结构，细胞内的各种分子是怎样运输传递的？显然不会是漂浮在细胞中简单的自由扩散——细胞能保持其特有性状，主要是因为细胞内还有无数的微管蛋白相互交联，支撑起薄薄的细胞膜和众多胞内结构。这些被称为“细胞骨架”的蛋白同时也担负着细胞内物质运输高速公路的责任，蛋白轨道上无时无刻不有“货物“运输——营养物质、更换零件、和其他重要材料，从而保证了整个细胞功能的完整。马达蛋白（motor proteins）的样子就像一对腿支持着长竿状尾巴，沿着细胞公路运送货物。 人类基因组表达45种被称为驱动蛋白的马达蛋白，其中15 - 20种参与运输包在囊泡内的重要组分。但驱动蛋白怎么知道谁负责携带什么货物、要去哪里?要回答此类问题，研究人员常常会表达一个带有绿色荧光蛋白(gfp)标记的目标蛋白质——将样本放在紫外灯下就可以观察标记蛋白是否存在。只是用gfp标记的马达蛋白观察它们到哪些地方去，并不太起作用——因为无处不在的马达蛋白在运送它们的业务洪流会充满整个场景，就像一个细胞版的光污染场景。为了变通，先前的研究仅表达并用gfp标记马达蛋白的“腿”这一部分——即“马达区”，并观察这些空的“腿”去哪些地方旅行了。 这些实验提供了证据支持“智能马达”的理论——假设调控马达蛋白“要到哪里去”是通过马达区的偏向性来完成的，每个驱动蛋白只在特定的微管中运行，在这些微管终端之间运送囊泡“行李”。但是rensselaer 理工学院生物科学、生物技术和跨学科研究中心的助理教授bentley的研究结果表明,“智能马达”并不是唯一起作用的调控方法。bentley实验室开发的一种新的成像技术能够将细胞内的马达蛋白与其携带哪些“货物”匹配起来，这更新了原有的关于细胞内运输如何到达其正确目的地的观点（智能马达论）。 这项研究集中在神经元细胞，将有助于揭示一些神经退行性疾病背后的机制。文章发表在本期的traffic杂志上。“我们发现，一定有别的调控机制，不同于传统的如何在细胞内引导驱动马达蛋白的观点,”marvin bentley是rensselaer 理工学院生物科学、生物技术和跨学科研究中心的助理教授。 “有一个神秘的相互作用是我们所不知道的。”bentley的实验室开发了一种技术，仅表达每个驱动蛋白的尾巴并标记gfp（这回不表达“腿”了）。驱动蛋白尾巴结合特定的囊泡，可以显示哪种驱动蛋白会结合哪种货物，可以换一个不同角度来看“谁将带着什么货物要去哪里”。在细胞开始表达驱动蛋白尾巴的几个小时后，在视图还没有被越来越多发光的“尾巴”占满之前——研究人员能够观察到每个驱动蛋白结合的所有囊泡。结果表明,当结合囊泡之后,“智能马达”理论并不总是适用。有些驱动蛋白并没有出现在其“智能马达”偏向应该出现的地区，而有的甚至出现在他们本来不应该能去到的地方。“很明显,这不是仅由马达区域偏向性决定这些马达蛋白该去哪里，应该还有别的调节方式“bentley说。bentley怀疑配体蛋白参与其中，并希望进一步的研究揭示其确切的机制。“在细胞内，关键的神经递质和细胞内代谢物的运动极为复杂，但我们必须了解这些基本过程才能控制某些疾病——疾病中这种细胞内的交通运输已发生错误，尤其是在神经元细胞内。”curt breneman是rensselaer科学学院院长。 ”marvin在这个问题上的创新方法获得了一个令人感兴趣的见解，为开展进一步研究指出了一个新的方向。”

古老的结核病仍然是当今死亡率zui高的传染病——据世界卫生组织（who）统计，每年约900万人感染结核病，每年约140万人死于结核病。结核分枝杆菌主要攻击人类的肺部，也损害其他器官。对结核分枝杆菌来说，抑制其脂肪酸合成是对抗这种传染性细菌的重要目标之一。脂肪酸合成酶（fas）被认为是zui复杂的细胞机制之一。酵母、真菌和结核感染性分支杆菌的fas酶的结构差异较大，但是它们在涉及脂肪酸生产的结构上是非常相似的，酵母fas的发现也适用于细菌fas，而人体细胞的在三维结构上与它们又有足够的差异，因此，开发分支杆菌fas特异性抑制剂就可以有效地停止病原体增殖。max planck生物物理化学研究所的holger stark和ashwin chari团队花了6年时间刷新了对fas活性控制的认识，为开发抑制分支杆菌脂肪酸生物合成的活性化合物，或酶法修饰酵母fas开辟了新的可能性。为对抗结核病搭建了更好的起点。在酵母中，fas呈桶形，有2个圆顶和6个反应室。要形成脂肪酸（主要是棕榈酸，palmitic acid）需要7个反应步骤和不同的分子集团。每个步骤由脂肪酸工厂不同部分的酶催化。在这个过程中，脂肪酸需要从一种酶转移给另一种酶，完成任务的分子穿梭机名叫酰基载体蛋白(acp)。zui初，当博士生kashish singh向ashwin chari展示纯化的fas含有一个额外的亚单位时，合作博士生benjamin graf和singh的第1个想法是样本被污染了，实验白做了！但是chari对他们的研究结果是这样解释的：如果这个结构不是杂质，而是一个以前未知的fas的组成部分呢？又经过了两年多努力，zui终他们证实，它确实属于fas，研究人员将它命名为γ亚单位。“由于现在使用的纯化方法更为苛刻，这可能导致了几十年来γ亚单位的未被发现。下一个挑战是解决有和没有γ亚单位的fas三维结构，进而阐明该组件的功能。为此，graf和singh将x射线结构分析与低温电子显微镜结合起来。漫长的实验终于取得了成效。他们现在在《cell》发文，报道γ亚单位在脂肪酸生产的初期阶段辅助将脂肪酸工厂重置到起始位置。γ亚单位定义了fas内的功能分区，它能改变fas的结构使acp的穿梭路径更短。这个新认识还可用于对抗癌症。因为快速生长的癌细胞需要大量能量，许多肿瘤的脂肪酸生物合成工厂比正常身体细胞多，减少脂肪酸合成也可以抑制癌细胞增殖。反过来，脂肪酸是化妆品、肥皂、活性药物、生物燃料和调味料的组成，可持续地生物合成脂肪酸有助于摆脱现阶段对yuan油化工和植物油的依赖。酵母细胞生产的功能性脂肪酸可能在未来取代化石燃料。

欢迎大家来到-细胞培养知识小课堂今天我们要讲的是细胞”急救员”---抗生素细菌会使我们的细胞变得羸弱不堪直至死亡抗生素成为了细胞的大救星最早的抗生素-青霉素（Penicillin）是微生物学家弗莱明于自然界中发现的一种抗菌物质；至今，许多专家以合成或半合成的方式发明了更多种类的抗生素，用来对抗不同种类的细菌。如下图：▲细胞污染图抗菌法可简单分为5大类：抑制微生物细胞壁合成阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下溶胀破裂死亡，因哺乳动物细胞无细胞壁，不受此类药物影响，因而此类抗生素普遍细胞毒性较小。如：β-内酰胺类抗生素（Beta-lactam Antibiotic）为此原理破坏细胞膜功能与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性，打开膜上的离子通道，让细菌内部有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。如：多粘菌素（Polymyxin），达托霉素（Daptomycin）等为此类抗生素抑制遗传物质的复制及转录阻碍DNA复制，抑制细菌分裂繁殖；或阻碍DNA转录mRNA，使后续mRNA翻译蛋白的过程受阻。如：喹诺酮类（Quinolones），利福平（Rifampin）等为此类抗生素抑制蛋白合成与细菌核糖体或tRNA相互作用，抑制细胞存活所需的结构蛋白和酶等蛋白质合成进而杀死或抑制细菌生长。如：链霉素（Streptomycin），新霉素（Neomycin），庆大霉素（Gentamicin），卡那霉素（Kanamycin）等为此类抗生素影响微生物代谢功能细菌会产生叶酸并以此为养料，此类药物阻断细菌叶酸合成，进一步使细菌因叶酸不足而死亡。如：甲氧苄啶（Trimethoprim），磺酰胺（Sulfonamides）等为此类抗生素▲抗菌原理图又可根据功效分为两类：抑菌性（Bacteriostatic）抗生素无法直接杀死微生物，但能控制微生物增长速度，大多为抑制细胞壁或蛋白质合成的抗生素。杀菌型（Bactericidal）抗生素可直接破坏微生物本身，大多以破坏细胞膜结构，阻碍遗传物质复制或影响代谢功能而导致菌体死亡。纯抑菌型抗生素大多用于临床治疗，抑制病患体内细菌的生长速度，等待病患的免疫系统清除已存在的菌体，然而，体外细胞培养并没有免疫系统能帮助我们杀死菌体，所以大多数使用杀菌型抗生素来尝试清除细菌；但多种抗生素在低浓度的状况下为抑菌性，在高浓度状况下则有杀菌效果（转为杀菌型，如青霉素），因此实验中“预防性使用”或“补救性使用”上浓度会有调整，所以大家在购入使用抗生素前，记得仔细阅读产品说明书，也可咨询该产品技术支持噢。远慕生物也为大家总结一些使用抗生素时的问题，我们一起来看看吧~Q：青霉素（Penicillin）、链霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？A：青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成并发挥杀菌作用，对革兰阳性菌有效，但革兰阴性菌缺乏五肽交连桥，因此青霉素对其作用不大。链霉素作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，对革兰阴性菌有效。青链双抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)联合抑制细菌，可以有效杀灭G+、G-菌。Q：青链制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后会有黄色物质析出，属于正常现象吗？A：三抗本身是浓缩溶液，制真霉素在高浓度饱和状态水溶性差会被析出呈黄色物质，溶液外观略显浑浊，属于正常现象，客户可以放心使用。Q：原代细胞里加双抗或者三抗，会不会影响细胞生长？A：分离原代细胞初期，为了避免造成污染，一般会建议预防性加入适量双抗或者三抗，适量的抗生素用量对细胞的生长几乎没有影响，可以在细胞培养稳定后降低或移除抗生素。Q：支原体处理试剂如何使用？A：因支原体无细胞壁，故BI已开发全套支原体杀除试剂，可按说明书使用，如下。BIOMYC-1和BIOMYC-2的使用方法：加1ml的BIOMYC-1溶液至100ml培养基中，保持受污染的细胞在混合液中培养4天。期间需加入含BIOMYC-1溶液的少许的新培养基；4天后换液，加1ml BIOMYC-2溶液至100ml的新培养基中，并维持培养3天；以上是一个处理循环阶段，必要时可继续2－3次如上处理循环。在处理过程中，细胞需用来做支原体污染检测，以确认效果，从而适当减少实验过程。BIOMYC-3的使用方法：加1ml BIOMYC-3至100ml培养基中；持续培养14天，期间每2-3天更换一次培养基。在检测支原体前，请保持细胞在生长培养基中多维持14天。Q：支原体预防试剂如何使用？A：Aquaguard-1的建议浓度：1：100 无菌水稀释。CO2 培养箱使用的水是重要的污染源，将50ml Aquaguard-1溶液加至5L水中，每2-4周更换一次培养箱中的无菌水。Aquaguard-2的建议浓度：1：500 无菌水稀释。将2ml的Aquaquard-2浓缩液加入到1L水中，放置于水浴锅，建议1-2周更换一次。Q：请问如果培养基加入了支原体处理试剂的话，还需要再额外加抗生素吗?A：如果确认支原体污染，可以不用考虑添加双抗/三抗；如果是用于预防（一般细胞培养或是原代细胞分离），可以两者都加。Q：若培养箱污染，该如何处理？A：先用酒精清洁擦拭，然后使用IC-110100灭菌喷壶喷洒消毒，可有效预防真菌（和孢子）、细菌（和孢子）、支原体和病毒的生长和污染。Aquaquard-1（01-867-1B）是多功能性，即用型的浓缩溶液，将50ml Aquaguard-1溶液加至5L水中，加入培养箱的水盘。每2-4周更换一次培养箱中的无菌水。

近日，“上海科技大学—清华大学抗新冠病毒联合攻关团队”率先在国际上成功解析新型冠状病毒“RdRp（RNA依赖的RNA聚合酶）-nsp7-nsp8复合物”近原子分辨率的三维空间结构，揭示了该病毒遗传物质转录复制机器核心“引擎”的结构特征，为开发针对新冠肺炎的药物奠定了重要基础。3月17日，相关论文成果的预印本以“Structure of RNA-dependent RNA polymerase from 2019-nCoV, a major antiviral drug target”为题在线发表于BioRxiv（一个生物科学的开放式预印本存储库，相关论文未经同行评议）。新冠肺炎疫情爆发以来，迅速在世界范围内扩散流行，短时间内对世界各国造成了巨大冲击，对全人类产生了空前的影响。因此，针对新型冠状病毒的药物靶点研究以及新药的研发迫在眉睫。新型冠状病毒在入侵细胞后，便开始大量复制；而病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp，也被称为nsp12）在病毒的遗传物质—RNA的合成过程中起着至关重要的作用。以RNA聚合酶为核心，病毒会巧妙地利用其它辅助因子（如nsp7/nsp8等）组装一台高效的RNA合成机器，进行自我复制。RNA聚合酶作为这台复制机器的核心部件，是最重要的抗病毒药靶之一。破坏该核心设备的功能，就能阻止病毒的复制，最终达到治疗的目的。而瑞德西韦恰恰就是一个靶向RNA聚合酶的前药，当药物进入人体，通过代谢后，其最终产物就直接靶向抑制病毒的RNA聚合酶。瑞德西韦被认为是一个在新冠肺炎的治疗中颇具前景的临床药物。目前，瑞德西韦临床试验已在中国开展，由中日友好医院、中国医学科学院药物研究所牵头，在武汉金银潭医院等多家抗疫一线医院中进行，计划入组761例患者，结果预计在4月27日公布。但是，由于缺乏新型冠状病毒RNA聚合酶的三维结构信息，瑞德西韦如何精确靶向病毒RNA聚合酶的机制尚不明确，这是当前针对该靶点开展更有效的抗病毒药物开发及应用的重要障碍之一。饶子和院士研究团队自从2003年SARS冠状病毒爆发以来，就一直致力于冠状病毒关键药靶的研究以及抗病毒新药的研发。在这次新冠肺炎疫情袭来之初，饶子和、杨海涛教授等团队，率先在国际上解析了shou个新型冠状病毒蛋白（主蛋白酶）与抑制剂复合物的高分辨率三维晶体结构，并在临床试验药物中发现了可以有效抑制新型冠状病毒的抑制剂。在此基础上，由饶子和、娄智勇教授、王权教授等组成“上海科技大学—清华大学抗新冠病毒联合攻关团队”，率先在国际上成功解析了新型冠状病毒“RdRp-nsp7-nsp8”复制机器的三维空间结构，整体分辨率达到2.9?。解析的复合物结构显示，新型冠状病毒的RNA聚合酶具有其它病毒RNA聚合酶的保守特征，并含有套式病毒（nidovirus）的NiRAN特征结构域；同时病毒RNA聚合酶与病毒的辅助非结构因子nsp7/nsp8组成了复制机器。令人兴奋的是，研究人员还shou次在新型冠状病毒的RNA聚合酶的N端发现了一个独特的“β发卡”结构域，这一结构域的发现为阐明新型冠状病毒RNA聚合酶的生物学功能提供了新的线索。研究人员又通过对该原子分辨率结构的深入分析，发现了新型冠状病毒RNA聚合酶行使功能的关键氨基酸残基，并通过与“丙型肝炎病毒聚合酶ns5b-索非布韦效应分子”复合物结构进行比对，提出了瑞德西韦的效应分子（即代谢后的最终产物）抑制新型冠状病毒RNA聚合酶的可能作用模式。研究人员表示，这项研究shou次精细描绘出了新型冠状病毒“RdRp-nsp7-nsp8”复制机器的内部构造，并为瑞德西韦的效应分子如何精确靶向抑制复制机器的核心元件—病毒RNA聚合酶进而发挥药效活性，提出了合理的机制解释，这为深入研究新型冠状病毒复制的分子机理奠定了重要的理论基础，并为开发抗新冠肺炎的特效药开辟了新途径。《中国科学报》从上海科技大学获悉，为了方便科技工作者、特别是药物研发人员分析使用，该研究的分子结构坐标数据已经投递至蛋白质结构数据库（PDB）, 编号为 6M71。

西蒙弗雷泽大学（SFU）的研究人员将利用他们的开创性成像技术（Mango）来开发冠状病毒检测试剂盒以帮助解决COVID-19病毒检测。SFU的博士后Lena Dolgosheina以及分子生物学和生物化学教授Peter Unrau开发出Mango，它能够灵敏地检测RNA分子，有助于改进病毒（比如冠状病毒等）筛查，它同时提高了我们研究细胞功能的基础研究能力。由Unrau领导的zui新研究涉及使用Mango来检测活细胞内单个RNA分子。“我们是由分子组成的，所以当细胞内出了问题，就会在分子水平上发生，” Unrau说。“我们正在以Mango系统为催化剂，使我们不仅能够扩展基础研究问题，而且能够更快、更有效地检测冠状病毒等病原体。”Mango系统由一个RNA的Mango适体组成，它与荧光染料紧密而特异地结合在一起。适体就像磁铁一样锁定并结合那些染料分子。当染料被结合时会变得容易激活，并发出明亮的光。RNA分子被修饰成包含适体磁铁，并与细胞的其他部分有明显区别，这使得研究人员在显微镜下更容易看到和研究RNA分子。“细胞调节发生在RNA水平，”Unrau说，“很长一段时间以来，人们关注的焦点一直是蛋白质，但调节细胞内绝大多数过程的是RNA而不是蛋白质。”RNA Mango染料目前可从位于Richmond的Applied Biological Materials（ABM）公司购买。CIHR的冠状病毒研究资金将鼓励该团队开发一种称为Mango NABSA（基于核酸序列的扩增）的恒温测试方法。Mango NABSA试剂盒可用于检测冠状病毒。ABM公司作为合作伙伴积极参与该项目，并提供SFU团队zui初开发所需的酶和缓冲液。“Mango技术是zui先进的，癌症和其他疾病的有效治疗方法的发展需要更好的成像方法来快速了解细胞的工作细节，”Unrau补充说。该团队的研究结果发表在Nature Communications杂志上。

许多技术能跟踪大脑pH值改变，但你很难清楚大脑的精确pH值是多少。现在，日本科学家开发了一种新方法，开拓了这方面的先河。冈崎国立生理科学研究所（National Institute for physical Sciences）和丰桥大学本月发表在《Nature Communications》的一项研究，展示了一种测量大脑pH值的探针，与先前的技术相比，其时空精度有所提高。zui近一些研究发现pH值也会影响神经传递，也就是说，pH变化可能对正常脑功能和病理性脑状况有重要影响。然而，现有的测量脑pH值的方法要么空间和时间分辨率低（如磁共振成像），要么只能测量单个点（微电极）。有关pH值在神经传递中的具体作用还未被揭示。为了解决这个问题，日本的研究人员开发了一款特殊的神经电路传感器。“我们设计的质子图像传感器为测量活小鼠大脑活动应运而生，”这项研究的主要作者之一Hiroshi Horiuchi说。“在视觉体验任务中，小鼠大脑pH值变化，质子浓度也随之变化，”该研究的另一位主要作者Masakazu Agetsuma补充说。新探针比以前的探针更小，这样它对周围大脑的损伤小。结果显示，该设备不会损害小鼠大脑功能。“数据表明，该生物传感器的测量范围很宽，可以测量微秒到毫秒尺度的pH变化，”文章作者Kazuaki Sawada解释说。“利用探针测试小鼠在特定视觉刺激模式下的初级视觉皮层pH值变化，可以将pH值与空间感知模式联系起来。”“我们发现了一种新的大脑调节活动，”Junichi Nabekura说。“考虑到精神分裂症和双相情感障碍等心理障碍患者的大脑pH值异常，这项研究可能具有重要的临床意义。”

新冠肺炎的流行，让口罩成了生活的必需品；随着复工趋势的增加，越来越多的人戴口罩上班了。那你会区分口罩正反面吗？口罩戴错了根本就没有防护的效果，而且口罩的品种繁多：N99、KF94、KN95、KN90等等。哪种口罩会更好呢？如果不小心买到假口罩，怎么投诉呢？远慕生物给大家介绍一下。1、假口罩怎么投诉？至今一个多月，全国市场监管部门查获问题口罩8066万只，查获其他问题防护用品比如消毒水等37万件，累计查办非法制售口罩等防护用品案件2.7万件。下一步，市场监管部门将继续推进专项行动，对制售假冒伪劣口罩等防护用品的违法行为“严惩不赦”，对于重大、典型案件予以及时督查。同时市场监管部门将和公安机关密切配合，加强行刑衔接，向公安机关通报、移送涉嫌犯罪的案件线索，追究违法分子的刑事责任。2、一次性口罩的正反面怎么区分？第一种：金属条在日常中比较常见的就是医用类的口罩了，相信疫情期间九成都是医用口罩，那怎么区分呢？其实可以根据你金属条来区分，一般金属漆突出的这面就是属于外面的，而没有突出的则是内侧面。第二：折痕每隔口罩都有明显的折痕存在，那么可以通过折痕来区分哦。一般来说折痕向上的就是属于内侧面，而折痕向下的就是属于外面的。实在看不懂的可以试试多观察百叶窗就秒懂了。第三：线头如何区分口罩的正反面呢？可以从线头下手哦。每个找口都是有线头的， 而带有线头的那一面就是属于外面，反而则是属于内侧面。第四种：颜色其实在市面中有很多种类的口罩，不过对于医用类的口罩来说是蓝色白色或者是红色，这些口罩要怎么区分呢？其实很简单的这些颜色比较深的基本都是外侧的，而颜色比较偏白色或者是浅白的就是属于内侧。以上就是关于几种口罩的正反面的区分方法了，小编想说口罩主要就是避免病毒细菌的袭击，而一旦戴错口罩就可能会导致细菌的滋生，而且对于新冠肺炎病毒没有保护的效果，戴错口罩就等同于没有戴口罩出门一样，很容易感染哦。有关过期口罩，从接触到这么多个过期口罩来看唯一看到上面的1860有效率下降严重的情况，大部分都还在合格范围内甚至超预期的，所以只要是正规大厂出的口罩，过期的，如果存贮条件不要太恶劣的，都应该是能用的，特别是个人日常防护的时候，再差也是比一次性口罩要好的在什么场合待什么口罩也很重要，下图就详细又清楚给列出了：

皮肤的表皮由一层来自内部的干细胞组成，这些干细胞周期性地停止分裂向身体表面外移动。当细胞穿过随后的几层时，它们面临的环境（比如温度变化）越来越严酷，当接近表面时，细胞核和细胞器突然消失，细胞向鳞片化戏剧化转变。Rebecca C. Lancefield教授说： “我们确定了一种允许皮肤干细胞感知环境新变化，并迅速部署指令推动鳞片形成的机制。”Rebecca C. Lancefield实验室的前博士后研究员Felipe Garcia Quiroz发现了一些奇怪的现象：在皮肤细胞变成鳞片之前深色的蛋白质发生沉淀，类似于你将油倒入醋中并充分摇匀后看到的液滴。这种现象称为相分离，发生在性质不匹配的液体聚集在一起的情况。在细胞内，油滴的等效物还未得到充分研究。与许多细胞器不同，这些结构不受脂膜约束。研究人员怀疑，在皮肤细胞中的观察到得暗蛋白沉积（角质透明蛋白颗粒）是通过相分离形成的，并携带分子信息，一旦释放出来就会促使细胞迅速变平并死亡。为了证实这一想法，Quiroz等人开发了一种技术，在不干扰细胞正常过程的情况下可视化相分离动力学。他们用相分离传感器在显微镜下观察小鼠得透明角质颗粒的形成与分解。通过这种方法，研究人员证明一种名为filaggrin的蛋白质对颗粒形成起关键作用。“如果filaggrin功能不正常，相分离就不能发生，皮肤缺乏透明角质颗粒，细胞就不能对环境刺激做出反应。”研究人员怀疑filaggrin与丝聚蛋白突变相关的皮肤疾病（例如特应性皮炎相关突变）有关。“我们怀疑，缺乏这种相分离会导致皮肤屏障缺陷，在这种情况下出现皮炎、破裂等皮损。”迄今为止开发的大多数治疗方法都集中在抑制免疫系统上，但我们发现也许应该更仔细地观察屏障本身，Fuchs总结到。

美国威斯康星国家灵长类动物研究中心的戴夫·奥康纳清晨收到在伦敦的一名合作伙伴发来的论文预印本。这项研究在中国完成，两人通过企业协同云端办公软件Slack讨论了一上午。下午2点，奥康纳打开高清会议系统GoToMeeting，和多个机构的研究人员讨论改进研究计划，他们希望构建一个灵长类动物模型来研究新冠病毒。 疫情之下，科研人员实地研究与交流受限。但很多人如奥康纳一样，在即时交流软件和科研共享平台帮助下，纷纷开启“云端”科研模式。 “云端”科研新潮流 受疫情影响，一些学术会议已经取消，但思想碰撞并未因疫情停歇。美国艾滋病年会、第八届国际表征学习大会等更多会议已转到“云端”，哈佛大学、约翰斯·霍普金斯大学等机构也召开网络研讨会“会诊”疫情。 “上周我使用WebEX开会，全世界近60名专家参与，包括中国专家，”奥康纳对新华社记者说，“挑战只有时区不同。” 协同办公软件便于多人科研项目管理，即时通信软件保障随时交流，远程会议系统可即时开启全球头脑风暴。“这种即时全球交流让分享信息更容易。”奥康纳说。很多人建议“云会议”在疫情后继续，对节能减排也有贡献。 不过，由于大批研究人员无法返校，依赖实验的学科就没法在“云端”进行了。中国清华大学医学院胡小玉教授在美国细胞出版社微信公众号上写道：“从1月底迄今湿实验基本停顿，到岗人员仅能做到维持现有实验体系不崩塌，例如小鼠有饭吃，细胞泡液氮，钢瓶存口气而已。” 虽困难重重，但胡小玉觉得可利用这段时间修炼内功：包括每周一次的远程组会和小组讨论，文献阅读与分享以及写作指导，“期待一朝功成，重返实验室时，个个真气充盈、出招迅猛”。 中国的清华大学、武汉大学等高校已开始远程授课。“近4000门课全部上线，可能是历史首次。”清华大学药学院院长丁胜教授对记者说。美国斯坦福大学、华盛顿大学等高校也转为线上教学。 多位教师说，直播授课zui大挑战在于缺乏学生即时反馈，各种操作也影响教学连贯性，需慢慢适应。不过，大众可在公共视频平台和在校生一起听课，算是疫情中的“福利”。 数据共享再加深 面对疫情，全球科研争分夺秒，论文预印本网站是快速分享新成果的平台，数据和研究加速开放共享成为新趋势。 预印本是指未经同行评议就上传至公共平台的论文草稿，省去了正式发表的审稿流程。美国冷泉港实验室出版社运营着两大生物医学预印本网站BioRxiv和MedRxiv。社长约翰·英格利斯说，两个网站每天收到约10篇与新冠病毒有关的论文。 “相比以往疫情，这次疫情中科研人员对研究成果更加开放，这既因为资助机构和期刊等主张透明性，也由于更有效利用了新技术，更多科研人员在网上随时分享想法、图片等，分享数据是正确的事。”奥康纳说。 他回忆，2016年寨卡病毒暴发期间，在预印本网站发布研究结果会影响在期刊发文。而这一次，所有同行评议期刊不约而同支持将成果先发布在预印本网站。很多期刊也提前在网站公开论文初稿。 截至北京时间15日早8时，以“新冠病毒”为关键词在BioRxiv和MedRxiv上搜索，可分别找到393篇和373篇论文。 奥康纳说，他读过的所有新冠病毒相关文本都来自预印本网站，这有利有弊，“同行评议很耗时，延迟了结果发布，但完全透明的流程可能让危害公众的草率科研成果获得平台”。印度学者关于新冠病毒与艾滋病病毒关系的文章在BioRxiv发布后引发广泛质疑并撤稿就是例证。 “新技术或应用并非完美，预印本和期刊互为补充。预印本加速科技交流，未来也会不断优化。”丁胜说。无论是中国科研人员快速共享病毒基因序列、诊疗方案，还是期刊愈加开放，都是在试图及时沟通科学发现，令全球受益。 由丁胜担任主任的全球健康药物研发中心，也将其高通量筛选平台、化合物分子库等开放给全球科研人员，共同加速针对新冠病毒的药物研发。一家美国人工智能药物研发公司就利用平台数据，快速完成了药物建模。 社交媒体也推动了科学信息共享。最早激活奥康纳“科研雷达”的，是新年伊始一条武汉的病毒性肺炎疫情推特。他的实验室推特会分享成果接受公众检验。 “与公众沟通科研工作非常重要。就这次疫情而言，要让公众清晰了解新药物和疫苗研发真正投入应用所需时间，确保公众对此不会预期过高。”参与新冠疫苗研发的英国帝国理工学院医学院教授罗宾·沙托克说。 在多数科研人员看来，疫情之后，这种开放共享的科研文化也应当继续。 “与新冠肺炎疫情一样，流感、艾滋病、癌症和心脏病等其他疾病对人类影响同样严重。我们要将在新冠肺炎研究中分享数据和信息的传统延续，解决其他科学和医学挑战，这将是疫情留下的积极遗产。”奥康纳说。

新冠肺炎康复患者在一些地方出现核酸检测复阳现象，虽然复阳并不等于复发，但此类信息也给公众带来了一些恐慌，且可能增加防控成本。这一恐慌有望在科学研究的推动下获得缓解。2020年3月14日，中国医学科学院医学动物实验研究所秦川团队在预印版平台bioRxiv在线发表未经同行评审的题为“Reinfection could not occur in SARS-CoV-2 infected rhesus macaques”的研究论文。在这项研究中，对新冠病毒感染的猴子消失的症状进行了重新暴露的纵向追踪。研究人员发现，当初次感染新冠病毒后，在某些猴子中出现体重减轻，病毒主要在鼻子、咽、肺和肠中复制，以及在感染后第7天（dpi）出现中度间质性肺炎。猴子症状缓解并特异性抗体阳性后，用相同剂量的SARS-CoV-2毒株攻击一半感染的猴子。值得注意的是，在再次暴露的猴子中，未发现沿时间轴的鼻咽和肛men拭子中的病毒载量，也没有发现再感染（dpr）所有主要组织区隔中的病毒复制。结合后续的病毒学，放射学和病理学发现，再次暴露的猴子没有再出现新冠肺炎复发。该研究结果表明，原发性SARS-CoV-2感染可以防止随后的暴露，这对新冠肺炎疾病的预后和疫苗设计具有重要意义。虽然此次研究对象是猴子，但对于31省区市已确诊的超过八万例患者来讲，这可能也是一项重要的研究发现。此前，由于科学研究不足，出院患者检测复阳问题一定程度上增加了防控的成本和难度。3月4日，由于对于出院患者检测复阳患者的担心，武汉市江岸方舱医院曾发布了一份《紧急通知》称：根据市防疫指挥部zui新通报，近期出院患者中复发者较多，导致患者重新入院治疗。为了减少病情复发，确保大家彻底治愈，达到“零回头”目标，经医院研究决定，即日对所有在舱拟出院病友抽血加做病毒抗体Ig-M与Ig-G的检查，确保病友完全康复出院，敬请各位病友配合。上述检查将从3月5日开始。此前，多位专家也曾向第1财经记者表示复阳不等于复发。“目前没有复发的。有的是还没有好，有的是病好了，核酸还没有完全消失（不一定还有活病毒），但检查时有时无。”一位一线临床专家说。此外，核酸检测的准确性不仅取决于诊断试剂本身的灵敏性和特异性的高低，同时也取决于采样人员标准性以及患者体内病毒量的大小。“在患者咽喉部有时能取到病毒样本，有时取不到，所以会出现一些所谓的核酸阴性患者，其次，取样时操作不到位，也会取不到病毒样本，也会出现假阴性。不过，对恢复期的病人，尽管核酸阳性也不一定需要治疗。”上述临床专家称。一位免疫学专家也对第1财经表示，一旦病毒病毒感染，体内就产生了抗体了，这种抗体对人体有保护作用，对病毒的清除也会持续进行。目前从体内检测到核酸阳性，并不一定是活病毒，预后患者体内病毒片段会慢慢被清除。