在ELISA实验中，偶尔会遇到样品浓度挨近试剂盒的灵敏度就容易发生样本OD450值低于空白值的现象，特别是在血清和血浆样本中。这就有可能是基质效应导致的结果。     什么是基质效应呢？     首先我们要知道什么是基质，基质是指样品中目标分析物以外的部分。由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应。这是ELISA试剂盒开发和使用中需要避开的雷。     如何判断是否是基质效应呢？     当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是实验操作出现问题，这时应增加重复，进步操作技术。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。基质效应的原因错综复杂，有可能是样品中存在的基质导致原抗体的联络结合能力下降，便产生了样本值低于空白值的现象。导致样本值无法计算出数值，或许数值为负。     虽然原因复杂，但有方法可以用来评估基质效应。     第一种方法是采用线性稀释，一般来讲，抗原和捕获抗体、检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变。     第二种方法是掺入回收率实验，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。     那我们如何避免ELISA实验中基质效应？     基质效应可以通过产品研发阶段的优化尽可能去消除的。远慕生物针对ELISA产品研发进行了多种优化。ELISA试剂盒在开发进程中，标准品不选用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能选用其仿照物。我们量身定制的缓冲液系统，这些优化后的缓冲液体系能很好消除基质效应。还有当检测某个分析物时，其他相关因子或类似结构因子如果有非特异性结合，也会导致基质效应，我们也因此做了大量的交叉反应，确保没有明显的交叉反应和干扰。而且我们试剂盒必须通过严格的基质效应测试，全部包括线性稀释和掺入回收率实验，并把测试结果记录在说明书中。

    抽样操作是整个实验室检测流程的第一步，也是首先应当保证的重要环节。经常会有这样的情况：样品检测结果出现异常，我们排查了检测流程的方方面面都没有出现偏差，结果是样品在抽样时已经被污染。这样的情况事实上并不鲜见，如何杜绝呢？还得从规范抽样操作开始。由于不同类型的样品应采取不同的抽样操作，为了使抽样更加科学，下面针对不同样品的抽样操作进行分类阐述。    液体样品：    一般情况下，液体样品比较容易获得代表性样品。液态食品一般盛放在大罐中，取样时可连续或间歇搅拌。对于较小的容器，可在取样前将液体上下颠倒，使其完全混匀。取得的样品应放在已灭菌的容器中送往实验室，实验室在取样检测之前应当把液体再彻底混匀一次。    固体样品：    根据所取样品材料的不同，所使用的的工具也不同。固态样品常用的取样工具有解剖刀、勺子、软木钻、锯、钳子等，使用前均须灭菌。例如面粉或奶粉等已经混匀的食品，其成分质量均匀稳定，可以抽取少量样品检测。但散装样品就必须从多个点取样，且每个点都要单独处理，在检测前要彻底混匀。肉类、鱼类或类似食品既要在表皮取样，又要在深层取样，深层取样时要小心不要被表面污染。有些食品，如新鲜肉类或熟肉可用灭菌的解剖刀和钳子取样；冷冻食品在不解冻的状态下用锯、木钻或电钻，一般斜角钻入来获得深层样品；粉末状样品取样时，可用灭菌的取样器斜角插入箱底，样品填满取样器后提出箱外，再用灭菌勺从取样器的上、中、下部位采样。    水样：    取水样时，最-好选用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。对于氯-气处理过的水，取样后在100mL水样中加入0.1mL的2%的硫代硫酸钠溶液。取样时应特别注意防止样品的污染，样品应完全地充满取样瓶。如果样品时从水龙头上取得，龙头嘴的里外都应擦干净。打开水龙头让水流几分钟，关上水龙头并用酒精灯灼烧，再次打开水龙头让水流1-2min后再接样并装满取样瓶。这样的取样方法能确保供供水系统的细菌学分析的质量，但如果检测的目的是用于追踪微生物的污染源建议还应在水龙头灭菌前取样会在龙头的里外用棉拭子涂抹取样，以检测水龙头自身污染的可能性。从水库、池塘、井水、河流等取水样时，用无菌的器械或工具拿取瓶子和打开瓶塞，在流动水中取样品是瓶嘴应直接对着水流。大多数国家的官方取样程序中已明确规定了取样所用器械，如果不具备适当的取样仪器或临时取样工具，只能用手操作，但取样时，应特别小心，防止用手接触水样或取样瓶内部。    带包装食品:    直接食用的小包装食品尽可能取原包装，直到检测前不要开封防止污染；桶装或者大容器包装的液体或固体食品应用无菌取样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内，不要过度潮湿，以防食品中固有的细菌繁殖；对于桶装或大容量包装的冷冻食品，应从几个不同的部位用灭菌工具抽样，使之有充分的代表性，将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。若样品一旦融化，不可使其再冷冻，保持冷却即可。    表面采样：    通过惰性载体可以将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物检测，这阵惰性载体既不能引起微生物的死亡，也不应使其增殖。这样的载体包括清水、拭子等。要达到微生物既不死亡又不增殖很困难，因此取样后应当尽快进行检测。表面取样技术只能直接转移菌体，不能做系列稀释，只有在菌体数量较少的时候适用，其最大的优点是取样过程不破坏样品。常用的表面取样技术包括棉拭子、淋洗法、胶带法等，这里以棉拭子法为例。定性检测时，只要涂抹全部需要检测的表面即可。而进行的定量检测时，必须先用灭菌取样框确定被测试的区域。用干燥的棉花缠在4cm长，直径1-1.5mm的木棒或不锈钢棒上做成棉拭子（为了方便也可使用一次性棉签），放进合金试管中，盖上盖子后灭菌。取样时先将拭子在稀释液中浸湿，然后再待测样品表面缓慢旋转拭子平行用力涂抹两次。涂抹过程中应保证拭子在取样框内。取样后拭子重新装回有10mL取样溶液的试管中。    以上就是各种情况下无菌抽样的操作要求。无菌抽样的规范性是保证样品检测准确性的前提，因此我们在取样时应规范操作，确保从源头杜绝污染。

    在实验过程中，我们常常需要证明实验组相对于对照组某些蛋白质是多了还是少了，那么我们就需要先把细胞或组织中的蛋白质提取出来进行测量，今天就给大家介绍一下细胞与组织蛋白质提取的基本知识和步骤。    蛋白样品制备的原则：    1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失；    2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解；    3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-80℃，勿反复冻融已制备好的样品；    4.通过超速离心清除其余杂质。    一般的理解方法分为温和的裂解方法和剧烈的蛋白裂解方法。    温和的裂解方法    用于组成比较简单的样品，或分析某一特定的细胞器。    （1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞    （2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮冻融    （3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物；用于组织细胞    （4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有细胞壁的细胞    剧烈的蛋白裂解方法    常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。    （1）超声波裂解法：细胞样品    （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于含有细胞壁的微生物、藻类    （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于液氮中，随后研磨成粉末    （4）机械匀浆法：    （5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破细胞壁；用于细胞悬液或微生物    那么蛋白提取的步骤来了：    所需器材：低温高速离心机，匀浆搅拌器，超声仪，真空泵，细胞挂勺等。    所需试剂：RIPA裂解液，蛋白酶抑制剂（PMSF）,无菌PBS等。    蛋白样品提取    1、细胞蛋白的提取：    1.根据实验需要取出需要提取的细胞培养板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均应在在冰上进行。    2.每孔细胞（六孔板）中加入 1-2ml 4℃预冷的PBS溶液。平放轻轻摇动十秒钟清洗细胞，然后吸除洗液，共清洗洗细胞三次（目的是去除剩余的上清液），最后一次不吸除上清液。    3. 用刮勺将细胞轻轻刮下，接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中，置入4度离心机（提前开离心机预冷），离心1.5min，弃去上清液。    4.配置裂解液（所用裂解液为RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分释放），每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）。PS：PMSF属于蛋白酶抑制剂，可以减少蛋白质的讲解，另外的蛋白酶抑制剂还可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同时加入多种蛋白酶抑制剂。    5.将配置好的裂解液加入第3步获得的细胞沉淀中，一般5*10^6个细胞加入100ul的裂解液，然后吹打重悬，使细胞充分裂解。    6.用超声仪进一步裂解细胞：将细胞放置于冰上进行超声，一般功率选择为15%左右，裂解时间为1分钟（超声2s，休息4s），当超声一次后，离心管仍比较浑浊，可以间隔几分钟再次超声。    7.超声结束后，将细胞于4度离心机，12000rpm离心 25min。    8.将离心后的上清分装转移至1.5ml 离心管，保存于－80℃备用。    2、组织中总蛋白的提取：    1.将少量组织块置于 1.5ml离心管中，加入500ul含PMSF的强RIPA裂解液，先用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，当组织较软时（如脑组织），接着用1ml枪头不断地吹打吸取，然后用匀浆器进一步打碎组织，最后用超声仪进行超声裂解；当组织较韧时（如肌肉组织），可以直接用匀浆器打碎组织，最后用超声仪进行超声裂解。（裂解组织就是通过不同的方法让组织块不断变小）。    2.同上方法，将离心管置入 4度离心机，12000rpm离心25min，取上清分装于1.5ml离心管中并置于－80℃保存。

细胞程序性死亡 概念：细胞程序死亡(programmed cell death，PCD)也常常被称为细胞凋亡，是生物体发育过程中普遍存在的，是一个由基因决定的细胞主主动的有序的死亡方式。具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自-杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。而细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留瘢痕。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。 凋亡细胞的主要特征是(参见表15-2)：①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体;②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症;③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止;④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状;⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。理论意义：程序性细胞死亡在生物发育和维持正常生理活动过程中非常重要.在发育过程中，细胞不但要恰当地诞生，而且也要恰当地死亡。例如，人在胚胎阶段是有尾巴的，正因为组成尾巴的细胞恰当地死亡，才使我们在出生后没有尾巴.如果这些细胞没有恰当地死亡，就会出现长尾巴的新生儿.从胚胎、新生儿、婴儿、儿童到青少年，在这一系列人体发育成熟之前的阶段，总体来说细胞诞生得多，死亡得少，所以身体才能发育.发育成熟后，人体内细胞的诞生和死亡处于一个动态平衡阶段，一个成年人体内每天都有上万亿细胞诞生，同时又有上万亿细胞“程序性死亡”.两者处于一种动态平衡中，使人体器官维持合适的细胞数量得以正常运作的，正是“程序性细胞死亡”机制。(又如蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细生物发育过程中及成体组织中正常的细胞凋亡有助于保证细胞只在需要它们的时候和需要它们活的地方存活。这对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。)实践意义：如果调节细胞“自-杀”的基因出了问题，该死亡的细胞没有死亡，反而继续分裂繁殖，便会导致有问题或恶性细胞不受控制地增长，比如癌症;如果基因错向不该死的细胞发出“自-杀令”，不让之分裂繁殖，使不该死亡的淋巴细胞大批死亡，便破坏了人体的组织或免疫系统，比如艾滋病。控制“程序性细胞死亡”的基因有两类：一类是抑制细胞死亡的;另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么人类就能够敲响癌症和艾滋病的丧钟。当然，这个过程需经过一番艰苦努力，因为线虫只有959个细胞，而人体则有大约1000万亿个细胞。

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    蛋白质合成的反应体系、三种RNA在翻译中的作用、蛋白质合成过程可分为起始、延长、终止三个阶段。原核生物翻译起始与真核生物的区别。肽链合成后的加工修饰。蛋白质生物合成的干扰和抑制。    蛋白质的靶向输送。    一.参与蛋白质生物合成的物质    要点: 参与翻译过程的物质： 需要20种氨基酸作为原料、三种RNA、蛋白质因子（起始因子IF、延长因子EF及释放因子RF）、酶和ATP、GTP等， 共同协调完成蛋白质合成。    1.mRNA是翻译的直接模板    mRNA每3个碱基组成三联体密码子,决定一个氨基酸的信息。有64个密码子， 其中mRNA 5'端的AUG称为起始密码。UAG、UAA、UGA为肽链合成的终止信号， 其余61个密码子代表20种氨基酸。密码阅读方向是从5’到3’，决定翻译的方向性。    遗传密码有以下生物特性：    (1) 遗传密码的连续性，即从AUG开始，各密码子连续阅读而无间断，若有碱基插入或缺失，会造成框移突变；    (2) 简并性，大部分氨基酸有多个密码子，以2～4个居多，可有6个。这种由多种密码编码一种氨基酸的现象称为简并性。决定同一种氨基酸密码子的头两个碱基是相同的,第三位碱基不同,第三位碱基发生点突变时仍可翻译出正常的氨基酸；    (3) 摆动性，mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码严格配对。而密码第三位碱基与反密码第一位碱基不严格遵守配对规则，称为密码配对的摆动性。见表1-1.    表1-1 密码子、反密码子配对的摆动现象    tRNA反密码子第一个碱基 I U C A G    mRNA密码子第三个碱基 U,C,A A,G G U U,C    (4)通用性，生物体的遗传密码相同，称密码的普遍性。但线粒体密码子有例外。如AUA与AUG均代表Met和起始密码子；UGA为Trp密码子而不是终止密码子等。    2.核蛋白体是肽链合成的场所    核蛋白体由大、小亚基构成，每个亚基含不同的蛋白质和rRNA。大亚基有转肽酶活性，有容纳tRNA的二个部位: A位，即氨基酰位,P位，即肽酰位。    3.tRNA和氨基酰-tRNA    tRNA的作用是携带并转运特异氨基酸。tRNA分子上3'端的CCA序列是结合氨基酸的部位，反密码环可特异识别mRNA的密码序列。    (1)氨基酰-tRNA合成酶。    氨基酰-tRNA合成酶可高度特异识别氨基酸及tRNA底物，保证各氨基酸与相应数种tRNA准确结合。氨基酸-tRNA合成酶催化的反应分为两步：    氨基酸＋ATP-E───→氨基酸-AMP-E＋PPi    氨基酰-AMP-E＋tRNA ───→氨基酰-tRNA+AMP + E    此反应使氨基酸羧基活化，并使活化氨基酸转移到tRNA 3'端CCA-OH,形成氨基酸的活性形式,氨基酰-tRNA。    (2)氨基酰-tRNA的表示方法    原核细胞tRNA携带的甲硫氨酸可被甲酰化，称tRNAifmet，fMet- tRNAifmet专一识别起始密码AUG，第一个进入核蛋白体循环。    甲酰转移酶    N10-甲酰四氢叶酸＋Met－tRNAifmet─────→四氢叶酸＋fMet- tRNAifmet    基本要求:    1. 熟悉遗传密码的生物特性。    2. 掌握氨基酰-tRNA合成酶的催化活性及特异性.    3. 掌握三种RNA在蛋白质合成中的功能。    基本概念:    1. 遗传密码:模板上的核苷酸,三个为一组(三联体)决定一个氨基酸的种类,称为三联体密码。密码也决定蛋白质的一级结构。    2． 翻译： 蛋白质生物合成称为翻译，是指把核苷酸序列组成的遗传信息，破读为蛋白质分子的氨基酸排列顺序。    二.蛋白质生物合成过程    要点:翻译过程可分为起始、延长、终止三个阶段，蛋白质合成在核蛋白体上进行称为核蛋白体循环（广义）。肽链的合成是从N端到C端。    1.翻译起始 (原核生物)    生成由起始氨基酰-tRNA、mRNA和核蛋白体组成的70S起始复合物，原核生物的起始因子(IF)有三种。其过程在原核生物和真核大同小异。    (1)核蛋白体大、小亚基分离。    (2)mRNA结合小亚基 mRNA起始密码上游为S-D序列，可与小亚基16S rRNA 3'端互补。紧接S-D序列的短核苷酸序列可被小亚基蛋白识别结合，两方面作用促使mRNA在小亚基上定位。    （3）fmet-tRNAifmet结合于mRNA-小亚基复合体的AUG上，形成30S起始复合体。    (4)大亚基加入30S起始复合体，形成70S起始复合体。    （二）真核生物翻译起始的特点    真核生物核蛋白体为80S（60S + 40S）。10种起始因子（eIF），见下表。    表1-2 各种起始因子在形成起始复合物中的作用    生成起始复合物步骤 IF eIF    亚基分离起始tRNA就位mRNA就位大亚基结合 IF-3、IF-1IF-2、IF-1核酸-核酸、核酸-蛋白质之间的辨认结合各种IF脱落，GTP水解 eIF-3、eIF-3A、eIF-4CeIF-2、eIF2B、eIF- 3、eIF-4CeIF-4、eIF-4A、eIF-4B、eIF-4E 、eIF-4F    1.真核起始甲硫氨酸不需甲酰化。    2.真核mRNA没有S-D序列，但5'端帽子结构与其在核蛋白体就位相关。帽结合蛋白（CBP）可与mRNA帽子结合，促进mRNA与小亚基结合。    2.肽链的延长    延长阶段为不断循环进行的过程，也称核蛋白体循环。分为进位、成肽和转位三个步骤。真核及原核生物的延长，主要是延长因子体系的不同，见表1-3。    表1-3 真核和原核生物延长因子及其功能    原核生物 功能 真核生物    EFTuEFTsEFG 协助氨基酰-tRNA进入A位，结合GTP从EFTu中置换GDP转位酶，促助肽酰-tRNA由A位进至P位，协助tRNA的释放 EF1αEF1β、EF1γEF2    (1)进位    根据A位上密码引导，相应的氨基酰-tRNA进入A位，称为进位（注册）。EF-T由EF-Tu和EF-Ts两个亚基组成， EF-Tu-GTP与氨基酰-tRNA形成 氨基酰-tRNA-Tu-GTP三元复合物并进入A位，消耗GTP完成进位，释出EF-Tu-GDP，EF-Ts促进EF-Tu 释出GDP，并重新形成EF-T，再次被利用。    （2）成肽    转肽酶催化催化P位上甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移给A位上进入的氨基酰-tRNA，形成肽键连接，生成的二肽酰-tRNA占据A位，P位连有空载 tRNA，将迅速从核蛋白体脱落。    （3）转位    EFG有转位酶活性，催化A位二肽酰tRNA进入P位，同时核蛋白体沿mRNA移动一个密码子， A位再次空缺，开第3个氨基酰-tRNA进位。重复上述循环，肽链在N端加入一个氨基酸。使P位依次出现3肽、4肽等。    （一）肽链合成终止（原核）    终止需要释放因子RF、RR。真核生物仅需一种释放因子，有GTP酶活性。    1、任何氨基酰-tRNA不辨认终止密码，由 RF-1辨认终止密码UAA、UAG；RF-2辨认UAA、UGA。    2、RF-3可使转肽酶的构象改变，发挥酯酶活性水解多肽、脱离tRNA。    3、在RR作用下，tRNA、mRNA、RF与核蛋白体分离。大、小亚基分开，重新参与蛋白质合成过程。    （二）多聚核蛋白体循环：在翻译时多个核蛋白体结合于同一条mRNA上，称为在mRNA上的密度与模板的长度有关。可使蛋白质高速、高效同时合成多条肽链。    基本要求:    1. 掌握原核生物翻译起始的过程。    2．了解真核生物翻译起始的特点    3．熟悉原核生物肽链延长的三个步骤及延长因子的作用。    基本概念:    1. 核蛋白体循环（广义）：蛋白质合成的中心环节。是活化的氨基酸在核蛋白体上缩合成肽的过程。包括起始、延长、终止三个阶段。    2. S-D序列（核蛋白体结合序列）： mRNA起始密码AUG上游为富含嘌呤…AGGA…序列称S-D序列，可与小亚基16S rRNA 3'端互补结合。因此AGGA序列也被称为核蛋白体结合序列。    3．核蛋白体循环（狭义）指翻译过程的肽链延长阶段。循环包括进位、成肽和转位三个步骤。每循环一次，肽链延长一个氨基酸，形成一个肽键。如此周而复始，直至肽链合成终止。    三. 翻译后加工    要点:新合成的多肽链，经加工修饰，转变成有生物活性的蛋白质。    1.高级结构修饰    由多条肽链构成的蛋白质，各亚基合成后，需聚合成四级结构。细胞内多种结合蛋白如脂蛋白、色蛋白、核蛋白、糖蛋白等，合成后需和相应辅基结合。    2.一级结构的修饰    （1）去除起始甲硫氨酸    多肽链延长到一定程度，脱甲酰基酶或氨基肽酶切去起始N-甲酰基或N端甲硫氨酸。    （2）个别氨基酸的修饰    如肽链内或肽链间两个半胱氨酸形成二硫键。脯氨酸、赖氨酸羟基化生成羟脯氨酸和羟赖氨酸。某些蛋白质的丝、苏、酪氨酸可被磷酸化等。    （3）水解修饰    胰岛素、甲状旁腺素、生长素等激素初合成时是无活性的前体，经水解剪去部分肽段而成熟，如鸦片促黑皮素原经剪切可生成几种肽类激素。    3.蛋白质合成后的靶向运输    蛋白质合成后运送到相应功能部位，称为蛋白质的靶向运输。合成的蛋白按功能和去向分成两类，一类为分泌蛋白，由结合于粗面内质网的核蛋白体合成。另一类分布于胞液、线粒体及核内蛋白，由游离核蛋白体合成。    信号肽假说：信号肽位于新合成的分泌蛋白N端。对分泌蛋白的靶向运输起决定作用。①细胞内的信号肽识别颗粒（SRP）识别信号肽，使肽链合成暂时停止，SRP引导核蛋白体结合粗面内质网膜；②SRP识别、结合内质网膜上的对接蛋白,水解GTP使SRP分离，多肽链继续延长；③信号肽引导延长多肽进入内质网腔后，经信号肽酶切除。分泌蛋白在高尔基体包装成分泌颗粒出胞。    基本要求:    1．掌握翻译后加工的形式及意义。    2．熟悉蛋白质靶向输送的过程及意义。    基本概念:    1．信号肽:未成熟的分泌性蛋白质中可被细胞转运系统识别的特征性氨基酸序列，有碱性N-末端，疏水核心区，及加工区三个区段。    2．翻译后加工:将新合成的肽链经多种修饰加工处理，使之成为有生理活性的成熟蛋白质，称为翻译后加工。主要包括高级结构的修饰：亚基聚合、辅基连接。一级结构的修饰：去除N-甲酰基或N—蛋氨酸，个别氨基酸的修饰，水解修饰和靶向输送三方面。    四、蛋白质生物合成的干扰和抑制    要点:某些药物、毒素和生物活性物质等可干扰和抑制蛋白质生物合成过程。    1.抗生素类    通过直接阻断蛋白质生物合成而起抑菌作用。见表1－4。    表1-4 抗生素抑制蛋白质生物合成的原理    抗生素 作用点 作用原理    四环素族（金霉素 新霉素、土霉素）氯霉素、链霉素、卡那霉素、嘌呤霉素放线菌酮 原核核蛋白体小亚基原核核蛋白体大亚基原核核蛋白体小亚基原核核蛋白体大亚基真核核蛋白体大亚基 抑制氨酰-tRNA与小亚基结合抑制转肽酶、阻断延长改变构象引起读码错误、抑制起始抑制转肽酶、妨碍移位抑制转肽酶、阻断延长    2.干扰蛋白质合成的生物活性物质    （一）毒素    多种毒素在肽链延长阶段可阻断蛋白质合成，如白喉毒素,通过抑制翻译延长的移位，而抑制细菌蛋白质合成。    （二） 干扰素的作用    干扰素可抑制病毒繁殖。机理有两方面，一是在某些病毒双链RNA存在时，诱导特异蛋白激酶活化，使起始因子eIF2磷酸化失活，抑制病毒蛋白质合成；二是干扰素与双链RNA共同活化特殊的2’-5’A合成酶，生成 2’-5’A，再活化核酸内切酶RNase L，使病毒RNA降解。    基本要求:了解抗生素、毒素和干扰素阻断蛋白质生物合成的作用的机理。

    细胞因子（CK）是由活化免疫细胞和非免疫细胞（如某些基质细胞）合成分泌的能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应的小分子多肽或糖蛋白，是不同于免疫球蛋白和补体的又一类免疫分子。    根据来源最初将活化淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子（LK），将单核-吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子（MK）。目前根据功能，可将细胞因子粗略分为以下6类：    1.白细胞介素    白细胞介素（IL）简称白介素，最初被定义为由白细胞产生，在白细胞间发挥作用的细胞因子。虽然后来发现它们的产生细胞和作用细胞并非局限于白细胞，但这一名称仍被沿用。目前已报道的白细胞介素有18种，摘要列表如下：    2.干扰素（IFN）    干扰素是最先发现的细胞因子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称为干扰素。根据来源和理化性质，可将干扰素分为α、β和γ三种类型。IFN-α/β主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，称为Ⅰ型干扰素。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产生，称为Ⅱ型干扰素。    丙型干扰素生物学性能比较详见下表：    3.肿瘤坏死因子（TNF）    肿瘤坏死因子是一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子。1975年Garwell等将卡介苗注射给荷瘤小鼠，两周后再注射脂多糖，结果在小鼠血清中发现一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，称为肿瘤坏死因子。肿瘤坏死因子分为TNF-αTNF-β两种，前者主要由脂多糖/卡介苗活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶病质素；后者主要由抗原/有丝分裂原激活的T细胞产生，又称淋巴毒素。TNF-α/β为同源三聚体分子，主要生物学作用如下：    （1）对肿瘤细胞和病毒感染细胞有生长抑制和细胞毒作用；    （2）激活巨噬细胞、NK细胞，增强吞噬杀伤功能，间接发挥抗感染、抗肿瘤作用；    （3）增强T、B细胞对抗原和有丝分裂原的增生反应，促进MHC-Ⅰ类分子表达，增强Tc细胞杀伤活性；    （4）诱导血管内皮细胞表达粘附分子和分泌IL-1、IL-6、IL-8、CSF等细胞因子促进炎症反应发生；    （5）直接作用或刺激巨噬细胞释放IL-1间接作用下丘脑体温调节中枢引起发热；    （6）引起代谢紊乱，重者出现恶病质。    4.集落刺激因子（CSF）    集落刺激因子是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化，阶段造血干细胞增殖分化在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。主要包括：干细胞生成因子（SCF）多能集落刺激因子（IL-3）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和促红细胞生成素（EPO）。上述集落刺激因子除具有刺激不同发育分化阶段造血干细胞增生分化的功能外，其中有些还能促进或增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀伤功能。    5.生长因子    生长因子是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。有些生长因子被直接命中为生长因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍生的生长因子和细胞生长因子等。多种细胞因子都具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如IL-2是T细胞的生长因子，TNF是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现抑制活性。生长因子在免疫应答、肿瘤发生、损伤修复等方面有重要作用。    6.趋化因子    趋化因子是一组由70～90个氨基酸组成的小分子量的蛋白质（8～10kD）。几乎所有趋化因子分子的多肽链中都有4个保守的丝氨酸残基，并对白细胞具有正向的趋化和激活作用。根据其氨基酸序列中丝氨酸的数量和位置关系，将其分为4大类或4个亚家族。    （1）α趋化因子，其近氨基端的两个丝氨酸残基之间被一个任意的氨基酸残基分隔，故称CXC趋化因子；    （2）β趋化因子，其近氨基端的两个丝氨酸残基是相邻排列的，即CC趋化因子；    （3）γ趋化因子，只有两个丝氨酸残基，其中一个位于多肽链的氨基端，又被称为C趋化因子；    （4）δ趋化因子，其氨基端的两个丝氨酸之间被其他三个氨基酸残基分隔，即CX3C趋化因子。

    我国的化学试剂基本上按纯度(杂质含量的多少)划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要有优级纯、分级纯和化学纯3种。    (1)优级纯(GR)，又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最-高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。    (2)分析纯(AR)，又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。    (3)化学纯(CP)，又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色(深蓝色)标签。    (4)实验试剂(LR)，又称四级试剂。    (5)基准试剂(PT)，专门作为基准物用，可直接配制标准溶液。    (6)光谱纯试剂(SP)，表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。    (7)高纯试剂(≥ 99.99%)。纯度远高于优级纯    我国的化学试剂基本上按纯度(杂质含量的多少)划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要有优级纯、分级纯和化学纯3种。    (1)优级纯(GR)，又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最-高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。    (2)分析纯(AR)，又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。    (3)化学纯(CP)，又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色(深蓝色)标签。    (4)实验试剂(LR)，又称四级试剂。    (5)基准试剂(PT)，专门作为基准物用，可直接配制标准溶液。    (6)光谱纯试剂(SP)，表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。    (7)高纯试剂(≥ 99.99%)。纯度远高于优级纯    生化学试剂购买小贴士：    1.  购买时要注意试剂标签的名称(包括俗名)、类别、产品标准、含量、规格、生产厂家、出厂批号(或生产日期)    2.  到货后及时填写验收、入库、领用记录。试剂开瓶时写上开瓶日期和限用日期（根据自己的使用情况规定3-5年）然后用不干胶贴在不遮挡标志的空白处    3.购买化学试剂一定要在有正规进货渠道的正规供应商处购买按照国家标准和化工部行业标准生产的试剂

    标准品实际上就是大家所说的标准物品，它所充当的角色就是衡量标准，专门用做药物方面对照品的一种衡量标准，即为含量测定中的标准含量。标准品种类也是多式多样的，常见的有冶金标准品、化学计量标准品和药检标准品等。虽然标准品与对照品有一定的区别，但是标准品或对照品混用的现象是司空见惯的，这就带来了一定的麻烦。那么，为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢?下面小编来给大家简单分析一下其原因。    为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢：    (1)卫生部提供的对照品使用说明书不够详尽，极其关键部分并没有做一个详尽的介绍，大多无对照品质量要求及标定方法，这就使得人们在使用标准品和对照品的时候出现了纰漏。    (2)使用者们对标准品或者对照品，甚至是两者的正确使用方法知识相当的缺乏，正所谓要使用一个东西就必须对其有一个充分的了解，所以在不了解的情况下出现错误是情理之中的。    (3)日常科研中极难找到相应的对照品，所以科研人员就只好用标准品代替对照品，久而久之大家就搞混了两者的区别。    (4)中国药典正文中也常存在对照品混用的问题，如常将含量测定用的标准品或对照品用于溶出度检查，而含量测定方法与溶出度分析方法又不同，故极易引起混用。    总而言之，上述所介绍的四点就是标准品和对照品常常出现混用情况的原因，希望大家在彻底了解了其相关原因之后，能够竭尽所能的改正自己常常犯的错误，在使用标准品或者对照品的时候，大家首先务必要认真检测自己是否拿错了，接着看看标准品和对照品的说明书，然后在正确将其投入使用中。

    标准物质是以特性量值的均匀性、稳定性和准确性等特性为主要特征的。为获得这些基本特征，标准物质起码应满足以下基本条件的要求：    1、材质均匀    从理论上讲，如果物质的一部分(单元)的特性值与另一部分(单元)的特性值没有显著差异，则该物质的该特性是均匀的。但是，完全均匀的物质是不存在的，物质内部和单元之问或多或少会存在有不均匀性，在贮存过程中，也会发生层析、偏析、聚集等不均匀的倾向，因而，均匀是相对的，而不均匀是绝对的。    如果物质的一部分(单元)的特性值与另一部分(单元)的特性值之间的差异不能被实验检测出来，或检测出来的差异很小且相对于测量准确度要求来说是可以忽略的，则该物质的该特性就可以视为“均匀”的。均匀性就是与“物质的一种或多种特性相关的具有相同结构或组成的状态。”由于标准物质的特殊功能和用途，因而对其均匀性具有很高的要求。然而，物质各部分之间特性量值是否存在差异，必须用实验方法才能确定。    因此，所谓均匀性是指物质各部分之间特性量值的不能用实验方法“准确地”检测出来。这样，均匀性的实际概念就包括物质本身的特性和所用的测量方法的精-密度(标准偏差)和样品的大小(实验取样量)等。在许多情况下，测量方法可能达到的精-密度与取样量有关，因此，标准物质的均匀性是对给定的取样量而言。通常，标准物质证书中都要给出均匀性检验时的取样量，作为使用时的最小取样量。    2、量值稳定    标准物质在规定的时间和环境条件下，其特性量值应保持在规定的范围以内。这种特性亦被称之为标准物质的稳定性。    研制(生产)者要保证所提供的标准物质在一定期限内其特性量值不发生显著改变。为得出这一期限，研制者在研制标准物质过程中必须要进行稳定性考察，量值不稳定的物质不能用来制备标准物质。我国规定一级标准物质的稳定性一般应大于1年。    3、认定量值准确    量值准确可靠是标准物质的重要特征之一，是指标准物质具有准确的或严格定义的认定值(亦称标准值)。正是由于标准物质具有认定的参考值，参考值的准确度高且具有规定的不确定度，因而才能够成为计量学溯源链的重要单元，用于测量仪器的校准或检定、测量方法的评价或确认，以及测量审核与能力验证等量值传递或溯源有关的活动。从这个意义上来说，标准物质必须在有资质的实验室，由具有一定资质和经验的操作人员，用准确可靠的测量方法进行定值测量。    当以某种测量方法来对标准物质进行定值测量时，认定值是对被认定特性量之值的最佳估计，认定值与真值的偏离不超过定值测量的不确定度。    4、附有特定的证书    有证标准物质必须带有特定的“证书”，它是介绍标准物质特性的主要技术文件，是标准物质研制者(生产者)向使用者提供的质量保证书。证书上需注明该标准物质的认定(标准)值、认定值的不确定度、正确使用方法、运输与贮存应注意的有关事项等。证书的编写与内容应符合国-际标准化组织/标准物质委员会(ISO/REMCO)发布的技术文件(IS0导则31：1981)和国家计量主管部门颁布的证书编写相关规则(参见本书第三章)的要求。    5、可批量生产    标准物质必须有足够的批量和储备，以满足测量工作对标准物质的实际需要。尤其二级(即工作级)标准物质，直接用于现场分析测量，需求量很大。对于性能比较稳定的金属、岩石、矿石等类标准物质，一批的制备量最好能满足现场分析测量5～10年的使用量。    6、具有与被测物质相近的组成和特性    使用标准物质确定待测物质的量值时。为消除由于标准物质与待测物质两者在基体材质和测量范围上的不同而带来的系统影响，研制者应选择与待测物质性质和组成相近似的物质作为标准物质的候选物，这是研制和使用标准物质应遵循的一条原则。    在制备标准物质时，生产者有意识地选择某些材料或人工合成一些材料，例如：采集果树叶，模拟生物化学和环境分析中植物的基体;人工合成含有痕量元素的玻璃来作为矿物成分的基体;模拟海水、河水、酸雨作水质标准物质的基体等，这些作法都是为消除在使用标准物质进行测量时由于基体差异而产生的影响。

标准品，即标准品，作为中药标准参比资料研究中心的丈量标准；关于药物，它们是含量测定中的标准内容。标准品包含化学计量、冶金和药物标准。对照品，如标准品，是指标准品用于识别、国家药品标准查看、含量测定、杂质和有关物质查看。他们是国家药品标准的一个组成部分。国家药品标准品是国家药品标准的物质基础。这是一个特殊的丈量仪器，用于查看药品质量。它是衡量药品质量的基准。它也用于校准测验仪器和办法的资料标准。在药品查验中，它是药品质量和药品质量的比较。它是操控药品质量的一个必不可少的工具。现在现在我国医药生物制品研究所供给了2930种国家标准品，包含650种中药化学参比物质和730种对照物质。关于标准品的办理主要有以下几点：来源问题依据有关规则，我国制品药查验运用的标准品（参比物质）的来源是：一是我国药品和生物制品查验供给的标准品（参比物质）；国家（参比物质）；三、省级药品查验组织校准并经同级食品药品监督办理局同意的标准品（参比物质）。但是，咱们在现场查看中发现，一些制药厂家由于某些原因运用精制原料药或“作业标准品（参比物质）”。“作业标准”（参考）是指作为标准品（对照品）运用的药品，其已知含量在本实验室内校准。作业标准产品（参考资料）的办理要求以标准产品（参考资料）替代标准产品（参考资料）进行制品查验。运用中的问题运用作业标准（参考资料）中的问题。尽管作业标准（参考资料）已由有关部门同意，但要求有相关文件，如标准化日期、重标日期、贮存条件、运用情况等和记载，但有些企业不符合上述要求。大多数企业没有规则从头招标和贮存条件的期限，一旦标定，直到其运用期结束，其运用期限没有核实；有些企业有记载不完整，运用作业标准（参考资料）无法追溯到源头。阐明我国药品和生物制品查验供给的标准品（参比物质）大多没有阐明书和运用寿命。它们大多遵循新批量出现、老批量主动停止的办理模式。正确性验证依据标准产品（参考资料）的办理要求，运用前应进行验证，确认后运用。大多数企业没有展开这项作业。开封办理开封市标准（参考资料）办理中存在的问题。有些企业开业后没有对标准产品（参考资料）的办理作出任何文件规则，仍与未开业的标准产品（参考资料）一起运用。包装上没有符号。从外观上，咱们不能看到它是否被翻开，何时被翻开，以及它包含多少信息。其他问题一些企业在标准产品（参考资料）的办理上还存在着注册混乱、账目不共同、运用不标准、仓储条件不共同等问题。依据国家食品药品监督办理局《药品注册办理办法（试行）》的界说，药品标准品和对照品是指为设备校准、计量办法评价或受试药品分配供给一定特征量的物质。GS。标准品（参比物质）的浓度由于办理不当或超越其运用寿命而降低，特别是标准品（参比物质）储藏溶液和敞开标准品（参比物质）。降低标准品（对照品）的浓度将导致作为对照丈量的药物含量高于实际含量。一方面可能使低含量不合格的药物成为合格的药物，另一方面也影响原料药和中间体的质量操控。制药企业应首要把握标准品（参比物质）的来源，运用国家同意的标准品（参比物质），并依据要求核实其正确性；其次，核实标准品（参比物质）、开封标准的贮存条件和运用寿命。作业中的物质（参比物质）和参比物质（参比物质），并注明文件。文件规则所有的记载都应该同时进行。第三，做好标准产品（参考资料）的管帐办理和运用登记，按要求做好，并按规则条件保存。第四，转变观念，知道本钱-价值曲线，避免小丢失对产品质量和人民药品安全的影响。第五，咱们主张标准和参考资料的供货商应供给每种标准的运用阐明。那么怎样差异标准品呢？标准菌株是指用于生物验证、抗生素或生物药物的含量或效价测定的标准品，以效价单位（U）表示。或许不清楚该标准是否仅用于生物意图？它只是化学中的对照品吗？标准产品的要求是什么？对照品的要求是什么？国家标准品和生物参比菌株是指用于判定、查验含量或滴度测定的标准品。其制备和标准化应当符合《生物制品国家标准品的制备和校准规程》的要求，由国-务院药品监督办理部门指定的组织分发。企业作业标准或许参考资料在制定之前，必须依照国家标准或许参考资料进行标准化。参考菌株是指用于生物制品的物理和化学测定的特定物质，由生产单位以与产品生产过程相同的方式制备。标准品应尽可能与产品原溶液的配方共同，稳定性差。参加适宜的稳定剂测定搅扰物质。参比物质由国家药品监督办理组织审批，其标准不得低于产品质量标准。标准和操控产品附有阐明、质量要求、有效性和装载才能。生物制品标准品是指用于测定生物制品效价、活性或含量或用于判定和查看其特性的生物标准品或参比物质。参考资料的类型生物制品的标准品可分为两类。国家生物标准品系指按国际标准校准或由我国（无国际生物标准）研制的用于定量测定产品效价或毒性的标准品。它们的生物活性以国际单位（IU）或单位（U）表示。国家生物参比菌株，是指用国际标准品校准或我国研制的用于微生物（或其产品）定性判定或疾病诊断的生物试剂、生物资料或特异抗血清；检测某些产品的生物效价，如麻疹活疫苗效价或类毒素絮凝剂单位试验。给定对照品的效价以特定的活性单位表示，而不是以(IU)表示。含糊概念对照品与标准品是两个不同的概念。《我国药典》中有清晰的界说。在文献中，两个概念常常是混杂的。对照品是标准品，只考虑一种物质的两种制剂。产生错误的原因可能是某些药物既有对照品，又有标准品。例如，当用微生物法测定头孢克洛效价时，当用HPLC或UV测定头孢克洛的标准品时运用对照品，当用非那西丁作为熔点校准物质时，当用熔点站测定头孢克洛的含量时运用对照品。实质。同一物质的标准品和对照品的规格、校准办法和用处可能不同。标准与比照的差异1。标准品，即标准品，是作为药品的计量标准进行含量测守时的标准含量。标准包含化学计量、冶金和药物标准。采用生化法测定了15种标准品，包含林可霉素、新霉素、大观霉素、特拉霉素、链霉素、卡那霉素、绒毛膜促性腺激素、盐水酶、锌杆菌素、吉他林、安培酶、红霉素、催产素、庆大霉素和多西环素G。2。对照品，是指用于仪器性能判定、查验、含量测定和校准的标准品。化学办法用于测定，即一般仪器称为对照品。国家规则有地塞米松、土霉素、阿莫西林等107种。标准品和对照品是两个不同的概念。《我国药典》中有清晰的界说。标准品是指用于b的标准品。 

一、斜面接种（1）在肉膏蛋白胨斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者。（2）点燃酒精灯或煤气灯。（3）将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平状态。在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。（4）右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌（参照实验一），在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞（或试管帽），将其取出，并迅速烧灼管口。（5）将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使环接触管壁或管口。（6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种环逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时geng要注意此点。二、液体培养基接种向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体培养基后，应在液体表面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体从环上脱落，混进液体培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可将无菌水或液体培养基注入菌种试管，用接种环将菌苔刮下，再将菌种悬液以无菌吸管定量吸出加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出加入或直接倒入液体培养基。整个接种过程都要求无菌操作。三、穿刺接种用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管塞，烧灼接种针。上述几种接种法的无菌操作，凡未叙述的均按实验一操作。试验者应反复练习无菌操作接种技术，直至较熟练地掌握。四、将已接种的斜面、液体和半固体培养基放置28—30℃温箱，培养2—3天后取出观察结果，(不同微生物培养温度不同)。

1、金黄色葡萄菌检测第二法，从典型菌落中任选5个，是从一个平行样中选5个还是5个平行样加起来选5个？答案：从符合计数范围的稀释度三个平行样中任选五个做血浆凝固酶试验。2、微生物回收采用涂布法时，试验组1ml含菌量不大于100cfu。涂布时取供试液0.2ml，含菌量会不会太少，不利于计数？答案：涂布法回收准备工作是取隔夜培养物0.2ml，进行梯度稀释，大概稀释到10的6次方可以达到100cfu/ml，然后分别取0.3，0.3，0.4ml进行涂布，也可以前后两个梯度均进行334涂布。3、哪些奶粉需要检测阪崎肠杆菌，依据的标准是什么？答案：一段婴幼儿奶粉都需要，企业为保证其质量，因此会制定内部质量控制标准或规定对其相关原辅料，包装材料以及直接接触面等进行检测，当然包括奶粉量勺等。具体依照GB 10765-2010。4、在进行煮沸灭菌培养基配置过程中如何避免液体喷洒出来被烫伤的情况，有什么好的灭菌方法，又可以有效防护？答案：选择口径大的三角烧瓶，培养基以不超过三角烧瓶容积的1/3为宜，电炉上加盖石棉网，带上高温手套，专人看守防止爆沸。5、霉菌检测中PDA和孟加拉红培养基，效果一样吗？有没有哪种更适合哪一类？答案：PDA中氯霉素可以抑制细菌生长，孟加拉红不仅含有氯霉素抑制细菌生长，并且抑制繁殖较快的霉菌菌落的大小和高度，还作为着色剂，便于菌落观察。6、食品微生物检验大肠菌群和沙门氏菌要求调节PH，可以调整样品原液吗？如果调样品原液会对结果有影响吗？有些做原液，如果调整样品匀液，原液也得调整吗？答案：需要调节PH的样品种类不多，大部分食品ph在6-8之间。PH调节液体从原液开始调整；固体从十倍稀释度调节。除了个别样品（食醋等）调节PH需要较多试剂，其他样品仅需微量，对微生物检测来说影响很小。7、大肠菌群产气证实是十倍3，百倍3，千倍1，万倍1，选MPN是331还是311？答案：标准为GB 4789.3，稀释度选择选311。8、同一个样品，菌落总数约50，但霉菌酵母计数高达800，这样的数据可靠吗？答案：菌落总数是指一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数，那就可能包括在此条件下生长的霉菌和酵母，当然还是细菌占绝大多数，你检出的菌落总数比霉菌和酵母少得多也是可能的。可能你的样品中霉菌和酵母确实很多，而平板计数琼脂上的PH值、营养成分及培养温度并不适合你样品中的那些霉菌和酵母的生长，另外，培养条件也有一定的关系。9、培养基适用性检查是每次配置做还是换批号和厂家再做？答案：GB 4789.28 是国标对培养基的性能测试要求，验证每批购买要做，每批购买的培养基有不同批号则每个批号都要做，下次购买如果和本次购买批号等同依然要做，每批次做一次即可，若换厂家，必须要做。10、标准要求样品控制单增李斯特菌，是否可以应用李斯特菌快检卡进行检测，有什么优势？答案：本情况需根据实际情况对待，如果此产品其产品标准致病菌检测规定了检测单增李斯特，那么根据其产品标准引用的检测标准来选择检测方式方法，一般为国标，国标没有允许快检！如果是内部质量控制，则允许使用快速检测方法，以减少工作量。

    RIPA 裂解液用于样品总蛋白提取已经有三十多年的时间，但是他到底适不适合你的下游实验，这个事你考虑过吗？比如 RIPA 提到的蛋白图谱是否完整？ 和其他方法对比提取的蛋白有哪些差异？使用时有没有潜在问题？一句话：RIPA 到底靠不靠谱？    研究方法    分别使用 RIPA 和 2%SDS+超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白    WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 活性检测    主要发现    p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。    划重点：细胞凋亡研究时要慎用 RIPA    1、 研究方法    培养的结肠癌细胞分别使用 RIPA 和 NP-40 提取    用特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀    使用同样量 pp60-src 沉淀蛋白进行激酶检测    主要发现    使用 RIPA 提取蛋白，激酶活性比 NP-40 提取高了七倍    RIPA buffer 人工增加激酶活性    划重点：激酶活性检测时要慎用 RIPA    2、 研究方法    研究使用化学诱导和无诱导的人细胞系，总蛋白分别使用 RIPA 和柱式法蛋白提取    蛋白通过 SDS-PAGE 分离，进行 WB 检测磷酸化蛋白的对比    NT=细胞没有通过化学处理激活（基线水平），T=细胞通过化学激活处理。化学激活后，磷酸化蛋白（P）预期应比基线水平（NT）增加，非磷酸化蛋白（np）减少。    3、主要发现    通过 actin 条带强度可以证明蛋白样品是等量上样    STAT3 在两种提取方法中显示了同样的趋势    P56 在两种提取方法中却显示明显的不同    离心管柱法提取蛋白获得了预期的结果，但是 RIPA 获得了完全相反的结果    4、研究方法    野生型和突变型乳腺上皮细胞通过 RIPA 裂解液裂解，通过离心获取 RIPA 可溶性和不可溶性组份    RIPA 不可溶性组份用 SDS-PAGE 样品缓冲液溶解，使用多种抗体进行验证    5、主要发现    RIPA 不可溶性组份中有明显的蛋白丢失情况    野生型和突变型样品均有丢失蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白（pY-416c-Src）    划重点：在某些蛋白质磷酸化研究中慎用 RIPA    6、研究方法    使用 RIPA buffer 提取乳腺癌组织中总蛋白    RIPA 方法提取丢弃的不可溶性组份通过尿素裂解液再次提取蛋白    通过质谱分析两部分蛋白质图谱    7、主要发现    RIPA buffer 提取后不可溶性组份中含有很多种蛋白    几乎所有的细胞外基质蛋白都存在于不溶性组分中    不溶性组分中蛋白质的分子量平均高出 60%    RIPA 在 4 种乳腺癌样品提取中都产生了明显的蛋白丢失，主要是高分子量蛋白    划重点：细胞外基质研究时慎用 RIPA    8、研究方法    小鼠组织样品分别使用离心管柱法和 RIPA buffer 提取总蛋白    RIPA 提取后不可溶组份进一步使用离心管柱法进行提取    提取后的蛋白通过 SDS-PAGE 分离，考染进行对比    9、主要发现    RIPA 不可溶组份仍可以提取出蛋白，分子量从小于 20KD 到大于 120KD 范围，证明 RIPA 提蛋白有丢失    最明显的区域是低分子量蛋白    蛋白丢失是具有选择性，且不成比例的    不同的样品间蛋白丢失的图谱是不同的    划重点：定量，定性蛋白研究慎用 RIPA    What？看完一脸懵 X 吗？用了这么久的 RIPA 居然有这么多慎用，这也太不靠谱了，那该怎么办？    如果正在做以上实验研究遇到问题，那么务必要使用不同提取蛋白的方法来验证结果！

养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。上篇提到细胞培养的注意事项，反响热烈，这次就来讲讲细胞培养常见问题的原因及对策。1. 培养液 pH 值变化太快原因：CO2  张力不对培养瓶盖拧得太紧NaHCO3  缓冲系统缓冲力不足培养液中盐浓度不正确细菌、酵母或真菌污染对策：按培养液中 NaHCO3  浓度增加或减少培养箱内 CO2  浓度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 浓度 NaHCO3  对应 CO2  浓度为 5% 到 10%。或者改用不依赖 CO2  培养液松开瓶盖 1/4 圈加 HEPES 缓冲液至 10 到 25 mM 终浓度在 CO2  培养环境中改用基于 Earle’s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hank’s 盐配制的培养液丢弃培养物或用抗生素除菌2. 培养液出现沉淀，pH 值不变原因：用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来冰冻保存培养液对策：用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌将培养液加热到 37 ℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液3. 培养液出现沉淀，同时 pH 发生变化原因：细菌或真菌污染对策：丢弃培养物或用抗生素除菌4. 培养细胞不贴壁原因：胰蛋白酶消化过度支原体污染培养液中无贴壁因子对策：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物改变培养液成分5. 悬浮细胞成簇原因：培养液中含钙、镁离子支原体污染蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放 DNA对策：用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物用 DNase I 处理细胞6. 原代细胞培养物污染原因：原代培养组织在进入培养前已污染对策：培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织7. 培养细胞死亡原因：培养箱内无 CO2培养箱内温度波动太大细胞冻存或复苏过程中损伤培养液渗透压不正确培养液种有毒代谢产物堆积对策：检测培养箱内 CO2检查培养箱内温度取新的保存细胞种检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为 260～350 mOsm/kg。加入额外试剂如 HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。换入新鲜培养液8. 培养细胞生长减慢原因：由于更换不同培养液或血清培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏培养物中有少量细菌或真菌污染试剂保存不当接种细胞起始浓度太低，细胞已老化支原体污染对策：比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培养液需在 2～8 ℃ 避光保存。含血清完全培养液在 2～8 ℃ 保存，并在 2 周内用完增加接种细胞起始浓度，换用新的保种细胞分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物9. 保存血清最-好的方法？建议血清应保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。10. 如何解冻血清不会使其质量受损？建议将血清从冷冻箱取出后，先置于 2～8 ℃ 冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。11. 血清解冻后有絮状沉淀物怎么办？血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以 400 g 稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。12. 为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养 ES 细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。13. 有必要做热灭活吗？实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是「小黑点」，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37 ℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。14. 储存冰箱中的胎牛血清出现沉淀？GIBICO 的胎牛血清没有预老化，储存在 2～8 ℃ 时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在 -20 ℃ 储存胎牛血清，避免反复冻融。15. 如何避免沉淀物的产生？解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如 -20 ℃ 至 37 ℃），实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守 56 ℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

血清被广泛应用于细胞培养达几十年之久。动物血清主要包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等，其中以胎牛血清的使用最为普遍。动物血清在细胞培养中提供细胞增殖所需的生长因子、激素、转移蛋白、贴壁和铺展在培养基质上的因子、蛋白酶抑制剂和其他营养物质。使用血清的优点是血清含有促进细胞增殖和维持的大部分因子，它几乎是通用的生长添加物，适用于动物、人和昆虫细胞等的细胞培养。因而使用血清不需要为每一个细胞系优化培养基，节省了大量时间和精力。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2.提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。胎牛血清是高品质的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。既然血清在细胞培养中的作用如此重要，那么实验人在选择过程中一定要选择优质的牛血清哦。

1885年，W Roux尝试使组织离体培养，被认为是组织细胞培养技术的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术（Cell culture technology）的诞生。细胞培养是指从体内组织取出细胞膜，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。目前细胞培养方式主要包括以下三种：6.1 贴壁培养贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞。此类需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质（玻璃或塑料等无活性物质）的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制。大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，他们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面胜仗。6.2 悬浮培养来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式，可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。6.3 固定化培养动物细胞较微生物脆弱，易受剪切力等的影响，而细胞固定化技术可较好的保护细胞免受机械力及环境变化的影响，提高细胞的耐受力，促使细胞高密度培养，提高目的产物的产率。在传统的固定化酶技术中，常采用戊2醛、聚丙烯-酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中，一般使用较温和的固定方法，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化等，具有剪切力低、传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密度高、产物易于收集和分离纯化等特点。由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。

iPS细胞技术已经取得了举世瞩目的进展。一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦，也带来了新的挑战，细胞重编程有望迎来一个新的研究浪潮。尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而，未来iPS细胞的研究也面临着许多亟需解决的问题：第1，效率问题。目前，诱导产生iPS细胞的率仍然很低，这与基因导人的方式整合位点、表观遗传学等多种因素有关。这已成为制约iPS从实验室走向临床的最大瓶颈。因此，如何提高iPS细胞的制备效率仍是人们普遍关注的问题。第二，安全性问题。现在诱导iPS细胞通常借助逆转录病毒为载体，将几种癌基因转入分化细胞诱导其成为iPS细胞，而这种方法就有可能会因为外源基因插入细胞基因组，干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。第三，机制问题。细胞的多能性受到转录因子网络和表观遗传学的复杂调控，那么，仅仅依靠导人的几个转录因子是如何完成这一复杂的任务，从而诱导出具有多能性的细胞呢?深入研究体细胞重编程的分子机制，调控机制以及体外定向诱导分化机制也是未来研究的重要任务之一。1，逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范。2，需要深入研究比较iPS细胞和hES细胞在细胞生物学特性、 定向分化机制等方面是否具有显著的差异。3，需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险, 如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式, 或者用某些因子的短暂性表达代替永-久性导入。第四，提高制备iPS细胞的效率。需指出的是, iPS细胞研究的突破并不意味着ES细胞研究的衰亡, 因为iPS细胞所使用的转录因子正是来源于ES细胞长期研究的积累。

对于细胞培养而言，血清的重要性显而易见。它含有包括生长因子在内的蛋白、氨基酸、脂类、碳水化合物、维生素及其他成份，可以促进贴壁或悬浮细胞的生长和维持。胎牛血清（FBS）是细胞培养最常用的血清。随着全球生物学研究的迅猛发展，对血清的需求也越来越多，加上进口运输成本增加等等各种原因，进口血清的价格在国内也是悄悄地蹭蹭地，站到了「不菲」的价位。由于进口血清价格昂贵，购买渠道不明朗，市场上以次充好，假冒问题等日益放大，所以研究人员所关注的因素有以下几点：1、 血清供应连续性2、 血清批次一致性3、 实验数据的稳定性4、 价格是否有波动5、 产品的完整性注意：在水浴过程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化过程中要慢慢摇动，使血清混匀，但不要产生泡沫！与 4 ℃ 过夜法相比，三步法为什么对血清更好呢？重点有二！其一：关系到沉淀出现的几率！记得吗？血清在融化过程中，瓶子里冰块的底部你会看见亮亮的蛋白丝在下沉，如同蜂蜜溶于水时的亮线，这就是血清中大量的蛋白在快速融化，而水的熔点高于蛋白，融化的速度是比蛋白慢的。（回想一下高级冰淇淋和大棒冰的区别，你懂得！）试想，如果采用 4 ℃ 过夜的方法，1 瓶 500 毫升的血清融化好，大约需要 10 小时左右，蛋白先融化，沉降在瓶子的底部，水融化的速度比蛋白慢，于是造成大量蛋白溶于少量的水，此时就很容易有一些蛋白饱和析出，（大多是脂蛋白和纤连蛋白），这就是血清融化中产生沉淀的重要原因之一。采用三步法，只要 2.5 个小时，温和有效地加快了水融化的速度，另一方面，融化过程中可以间断轻轻摇摆瓶子，让蛋白在瓶中混匀。此方法不但节约了时间，而且最大限度减少了血清沉淀出现的几率。血清融化过程中，蛋白质会比水先融化。冰块底部亮亮的细丝就是融化中的蛋白。其二：血清在培养细胞中，最重要的是利用它的活性的因子，因此，融化过程中最大限度地保留因子的活性，就变得非常重要。回忆一下，细胞复苏时，要保持细胞的活性，我们是要遵循「快融」原则还是「慢融」原则呢？快融！血清同样如此！三步法需要两个半小时，4 ℃ 过夜需要大约 10 个小时（冰箱一般设 2-8 ℃，所以各实验室融化时间会稍有出入）。哪个速度对保留活性更好？不言而喻！养细胞不易，选对好血清，更是养好细胞的头等大事，希望以上信息对你有所帮助。

虾青素（ATX）为萜烯类不饱和化合物，是类胡萝卜素类的高级别产物，也是能透过血脑屏障的类胡萝卜素。近日，有媒体报道，研究显示，ATX具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等多种生物活性，可在体内、外广泛发挥神经保护作用。　　那么，虾青素，究竟能否保护神经？在该领域有哪些研究发现？　　虾青素是类胡萝卜素类、第四代抗氧化物质　　虾青素（ATX）又名虾黄质，是一种红色的脂溶性色素，属于类胡萝卜素，其化学名称为3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素，摩尔质量为596.84g/mol，分子式为C40H52O4。　　中国中医科学院医学实验中心及研发实验服务基地、中医药防治重大疾病基础研究北京市重点实验室副研究员欧阳竞锋告诉记者，天然虾青素在藻类、酵母、鱼、虾等水生动植物中存在广泛，目前可利用雨生红球藻和酵母红曲酵母进行合成。如红球藻种质培育与虾青素制品国家地方联合工程研究中心与云南爱尔康生物技术有限公司已通过培育雨生红球藻提取出虾青素。　　研究发现，虾青素是一种高度不饱和的萜烯类化合物，分子结构与β-胡萝卜素类似，由一条多烯烃链和两端的2个β-紫罗酮环组成，分子结构中酮基、羟基、长链共轭不饱和双键的存在使得虾青素共具抗氧化、抗炎症、抗凋亡等多种生物活性。“ATX的分子结构中共轭双键、酮基、羟基数量众多，电子效应活泼，可通过提供电子吸引自由基并与其反应，从而终止细胞内的自由基链式反应，因此ATX具有强大的抗氧化活性。”欧阳竞锋说。　　此外，两端β-紫罗酮环中所含羟基基团使ATX具有亲水性，多烯烃链的结构又使其具有疏水性，一方面使ATX能够更好地贯穿于细胞膜内外，增强细胞膜的稳定性与机械强度，避免损伤分子破坏神经细胞；另一方面ATX可由脂肪分子直接携带，穿过血脑屏障，以供大脑组织利用。　　欧阳竞锋表示，天然的ATX作为一种营养补充剂，具有相当高的安全性，无不良反应。日本一项随机临床试验发现，健康成人每天食用10毫克左右的虾青素，除了有益人体，无任何毒副作用。鉴于虾青素的强大抗氧化性和无任何毒副作用的特性，美国食品药品监督管理局于1999年批准其作为膳食补充剂，并于2009年批准雨生红球藻虾青素具有12项功能声称；欧盟FSA于2008年批准雨生红球藻虾青素为新资源食品，并对其五大功效做出健康声明；中国卫生部于2010年11月正式批准雨生红球藻以及来源于雨生红球藻的虾青素为新资源食品。　　研究显示虾青素可保护神经细胞　　神经退行性疾病主要包括阿尔兹海默症（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS)、亨廷顿病（HD）、雅氏病等疾病。这些疾病虽然病变部位及组织病理学改变有所差异，但均与氧化应激反应、神经炎症、线粒体功能障碍等因素密切相关，不同的分子机制及信号通路诱导了疾病的发生。　　欧阳竞锋介绍，ATX抗氧化、抗炎症、抗凋亡等生物活性在帕金森病(PD)、阿尔茨海默症（AD）的研究中不断取得新成果，但在其他神经退行性疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病（HD）的保护作用仍需更多研究证明。　　帕金森病(PD)以中脑黑质致密部多巴胺（DA）能神经元进行性变性丢失,嗜酸性路易小体（LB）形成为典型病理学改变。临床表现以静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势平衡障碍等症状为主。众多研究表明，氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍等是导致PD主要发病机制。　　有关ATX对PD影响的研究显示，ATX可在体内、外广泛发挥抗氧化、抗炎症、抗凋亡作用，保护神经细胞。ATX能够恢复抗过氧化酶的活性、抑制活性氧的产生及炎性因子的释放，抑制MPP+诱导的氧化应激及炎症反应对PC12细胞的损伤；ATX还可调控Bcl-2/Bax比例，下调α-synuclein表达，抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤；ATX可通过抑制线粒体膜电位的降低以及p38MAPK、caspase-3/caspase-9的激活，抑制6-OH-DA对SH-SY5Y细胞中线粒体功能的损伤，通过线粒体抗凋亡机制保护神经元；有关MPTP诱导的帕金森小鼠模型研究结果表明，ATX可缓解小鼠发作PD的相关症状，并显著延长小鼠滚筒运动的潜伏期，还可减慢DA的代谢率，促进DA的释放，提示与ATX能够提高脑内抗氧化物质水平有关。　　虾青素可抑制阿尔茨海默症的神经元损伤　　阿尔茨海默症（AD）又称为老年痴呆症，其典型病理特征之一为海马组织区域内出现以β淀粉样蛋白酶（Aβ）为主要成分的淀粉样斑块，该斑块在脑内的异常增加和沉积可诱导氧化应激反应和炎症反应，导致神经细胞的退化和凋亡，患者主要表现为渐进性记忆减退和认知功能障碍，氧化应激和神经炎症是导致AD的重要机制。　　近年来研究证明，ATX可通过抗氧化、抗炎症、抗凋亡机制抑制AD的神经元损伤。研究显示，ATX能够抑制Aβ引起的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的降低、Bcl-2/Bax比例的降低以及细胞色素C的释放； ATX预处理SH-SY5Y细胞后，可以剂量依赖性抑制Aβ引起的JNKs及p38MAPK的激活，从而抑制细胞内OS的过度产生，减少氧化应激对神经细胞的损伤，ATX还可通过激活ERK1/2通路、Akt/GSK-3β通路，上调HO-1表达，抑制谷氨酸诱导的细胞损伤与凋亡。　　欧阳竞锋表示，一项对有轻度认知功能障碍的AD患者进行的60d短期草本复方（含雨生红球藻的萃取物）疗法试验表明，日常服用含虾青素的复方可显著改善该类患者的记忆功能障碍，且无严重的不良反应，但由于受复方中其他成分的干扰，该试验中虾青素的单一效应有待进一步研究。　　虾青素在治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症研究中取得新进展　　肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS) 是一种由运动神经元渐进性变性导致的神经系统疾病，主要表现为进行性痉挛、反射亢进、肌无力及肌萎缩，氧化应激是导致该疾病的重要因素。　　研究发现，ALS患者编码铜锌超氧化物歧化酶的基因发生突变，该酶是对抗自由基的关键酶，基因突变导致其合成障碍，机体对自由基的清除能力下降，从而发生氧化应激反应，损伤运动神经元。研究证实，虾青素能够通过抑制氧化应激反应，保护神经元，降低ALS患者运动神经元的损伤，但其具体作用机制仍需深入研究。　　虾青素在神经退行性疾病研究中不断取得新进展　　欧阳竞锋指出，神经退行性疾病发病机制的复杂，给治疗方法创新与新药研发增加了困难。近年来虾青素在神经退行性疾病中的研究不断取得新进展，其对神经细胞所发挥的抗氧化、抗炎症、抗凋亡作用在众多体内、外研究中得到充分验证，相关机制的研究也不断深入。然而，目前关于虾青素应用于临床疾病治疗的研究尚不充分，对临床帕金森病、阿尔茨海默症、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病等神经退行性疾病的作用影响仍需大量研究。　　“虾青素对于神经细胞的保护具有巨大潜力，且对人体有很高的安全性。进一步探究其对神经细胞的保护机制及临床应用研究，有望为临床神经退行性疾病的治疗及新药研发提供新方向。”

柏林马克斯·普朗克分子遗传学研究所的一个研究小组探讨了在胚胎发育中的作用，这些因素不会改变DNA的序列，而只是表观基因地改变其"包装"。在科学杂志《自然》上，他们描述了调控机制如何有助于在早期小鼠胚胎中形成不同的组织和器官。受精卵细胞发展成一个完整的有机体，具有许多不同的组织和器官，尽管每个细胞的遗传信息完全相同。分子的复杂时钟工作调节体内哪个细胞完成每项任务，并确定激活每个基因的适当时间和地点。表观遗传调节因子是这种分子机制的一部分，它的作用是修改DNA分子的"包装"，而不改变潜在的遗传信息。具体来说，它们为DNA添加书签，并控制每个细胞中可以访问哪些部分。这些调节器中大多数是必不可少的，而缺乏这些调节器的胚胎往往在发育过程中死亡，当器官开始出现。然而，这些调节器可能具有每个细胞中不同的特定功能，因此难以研究。这也是研究这些蛋白质的主要障碍，这些蛋白质不仅与胚胎发育有关，而且与癌症的形成有关。详细检查胚胎"同一调节器存在于所有细胞中，但可以有非常不同的任务，这取决于细胞类型和发育时间，"斯特凡妮·格罗斯温特说，他是科学杂志《自然》新研究的首批作者之一。格罗斯文特和她的同事海伦·克雷茨默来自柏林马克斯·普朗克分子遗传学研究所(MPIMG)的亚历山大·梅斯纳实验室，与来自哈佛大学的扎卡里·史密斯一起，现在以前所未有的精-确度成功地阐明了表观遗传调节器对胚胎发育的意义。研究人员分析了十种最重要的表观遗传调节器。他们首先使用CRISPR-Cas9系统，专门移除受精卵母细胞调控因子的基因编码，然后在几天后观察对胚胎发育的影响。胚胎发育约六到九天后，研究小组检查了由于缺乏相关调节器而导致的解剖和分子变化。他们发现许多胚胎的细胞组成发生了重大变化。某些类型的细胞存在数量过多，而其他细胞则没有产生。分析数千个单个细胞为了在分子水平上理解这些变化，研究人员检查了来自胚胎的数百到数千个单个细胞，从这些细胞中系统地移除了单个表观遗传调节器。他们对近280，000个单个细胞的RNA分子进行测序，以调查功能丧失的后果。RNA中继编码在DNA上的信息，使研究人员能够利用测序技术了解细胞的身份和行为。在他们的分析中，科学家们专注于一个发展阶段，其中表观遗传调节器特别重要。当他们比较改变和未改变的胚胎的数据时，他们发现了被调节不良的基因，以及异常过度或过度生产的基因类型。从这个整体图中，他们推导出了许多表观遗传调节器以前未知的功能。发育过程中的复杂效果 八天大的老鼠胚胎看起来有点像海马，还没有任何器官。"从早期胚胎的外表，人们通常只能猜测哪些结构和器官将形成，哪些不会形成，"生物信息学家海伦·克雷茨默和生物学家扎卡里·史密斯说，他们也是该出版物的第1作者。"我们的测序允许geng精-确和高分辨率的视图。单细胞分析给了他们一个高度详细的视图，在鼠标开发的第九天。通常，关闭单个调节器导致整个相互作用基因网络的连锁反应，在发育过程中，许多不同活性或灭活基因。去除表观遗传调节器 Polycomb (PRC2) 的影响尤其显著。"没有 PRC2，胚胎看起来蛋形和非常小后，8天半，这是非常不寻常的，"克雷茨默说。"我们看到DNA的包装方式发生了巨大的变化，这种变化发生在胚胎出现形态异常之前。研究人员发现，PRC2负责限制生殖系祖细胞的数量，这些细胞后来成为精子和卵子。如果没有 PRC2，胚胎就会产生过多的这些细胞，失去形状，并在很短的时间后死亡。

对控制癌症生长和迁移的细胞信号的新见解可能有助于寻找有效的抗癌药物。麦吉尔(McGill)领导的一项研究揭示了关键的生化过程，这些过程促进了我们对大肠癌的认识，大肠癌是加拿大人中第三大常见癌症。利用萨斯喀彻温大学加拿大光源(CLS)的CMCF光束线，来自麦吉尔大学和日本大阪大学的科学家能够揭示一种参与癌细胞扩散的酶的行为。在《生物化学杂志》上发表的一项研究中，研究小组发现，酶PRL3与另一种将镁移入和移出细??胞的蛋白质之间存在微妙的相互作用。这种相互作用对于结直肠癌的生长至关重要。麦吉尔(McGill)生物化学教授及通讯作者卡勒·格林(Kalle Gehring)博士说：“这些酶首先在被激活以开始生长的肝细胞中被发现，因此它们以某种方式充当生长信号。”人们普遍认为PRL3蛋白可作为控制癌细胞的酶。因此，当Gehring和他的团队发现导致酶活性丧失的突变仍然对癌症的生长和迁移保持相同的影响时，令人感到惊讶。“我们的新论文表明，PRL3的第二种活性是控制镁转运蛋白的信号，它指示癌症转移到身体的其他部位。令人兴奋的是，这种无催化活性的突变蛋白，但仍与镁转运蛋白紧密结合，结果证明其与野生型蛋白一样致癌。” Gehring说。研究小组的发现质疑了关于PRL3在癌症扩散中的作用的长期假设，并指出结合机制在某种程度上是关键。了解结合镁转运蛋白而不是酶的催化活性会影响癌症的生长和迁移信号，这是鉴定新化合物以预防癌症扩散的关键信息。目前针对PRL3的药物筛选集中在鉴定可阻断磷酸酶活性的化合物。通过测试错误的功能，屏幕可能错过了其他具有治疗意义的化合物。将重点转移到酶与镁转运蛋白结合的能力上，是帮助公司通过药物筛选方法确定更好的癌症疗法的一种方法。

    ELISA试剂盒收到后立即储存于2-8℃下：效期见试剂盒标签；一切成分在2-8℃下可保存至有效期。运用前：一切试剂平衡至室温：不同批次的试剂不能交流运用。    1.停止液：1瓶：12ml：0.5M硫酸：储存于2-8℃至有效期 。    2. 胎球蛋白A示踪抗体：1瓶：0.6 ml：浓缩：HRP符号的抗人胎球蛋白A示踪抗体溶于稳定的蛋白基质中；此试剂运用前需用示踪剂抗体稀释液进行稀释；储存于2-8℃至有效期。    3. 包被板：96孔：包被了抗人胎球蛋白A抗体；微孔板固定于板架上：密封于含有干燥剂的铝箔密封袋内；储存于2-8℃至有效期。    4. 实验缓冲液：浓缩：1瓶：11ml：含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐；主张运用前以1:10比例用双蒸水稀释（如11 ml浓缩+99 ml的双蒸水）；储存于2-8℃至有效期。    5. 示踪抗体稀释液：1瓶：11ml：即用：Trizma盐酸溶于缓冲液；根据实验过程用于示踪抗体稀释；储存于2-8℃至有效期。    6. 洗涤液：浓缩：1瓶：20ml：30倍浓缩；实验前需用580ml的双蒸水稀释：混匀；一旦稀释：不含叠氮化物防腐剂的磷酸缓冲盐洗涤液会含表面活性剂；稀释的洗涤液在室温下可保存至效期。    7. HRP底物液：1瓶：12ml：含过氧化氢的TMB底物液；储存于2-8℃至有效期。    8. 胎球蛋白A规范品：5瓶：含胎球蛋白A：不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质；各规范品浓度见瓶子标签；3次冻存周期运用后：一切规范品保存至-20℃或更低。    9. 胎球蛋白A质控：2瓶：含人胎球蛋白A：不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质：各质控的准确浓度规模见瓶子标签：3次冻存周期运用后质控保存至-20℃或更低。

    “维生素D在早期生命中起着重要作用，支持骨骼代谢和婴儿免疫系统的健康发展，”资深作者、阿尔伯塔大学儿科学系教授Anita Kozyrskyj说。“北美的大多数婴儿接受维生素D，无论是作为母乳喂养的补充，还是作为商业婴儿配方奶粉的一种成分，因此我们想了解维生素D与婴儿肠道内主要细菌的存在或数量之间的关系。”    研究人员检查了1157名婴儿的粪便样本，    他们发现，无论婴儿是如何喂养（母乳喂养还是配方奶喂养），直接补充维生素D滴剂的婴儿都会导致Megamonas菌减少。先前的研究表明，这种细菌与哮喘或呼吸道病毒感染之间可能有联系，因此维生素D可能对儿童健康有额外的益处，值得进一步研究。    研究人员还评估了婴儿和母亲补充维生素D与婴儿肠道中艰难梭菌（C.difficile）的存在之间的关系。“有些婴儿肠道内携带引起腹泻的艰难梭菌，但没有任何症状。然而，当肠道细菌的水平变得不平衡时，这种特殊的细菌会繁殖，导致疾病，并增加儿童后期对慢性病的易感性，”第一作者Kelsea Drall评论道。    研究发现，近30%的婴儿携带艰难梭菌，但在纯母乳喂养的婴儿中，这种细菌的发病率较低。然而，无论是婴儿补充维生素D滴剂还是母亲在怀孕期间或分娩后补充维生素D，都与艰难梭菌定植无关。“有趣的是，母亲食用维生素D强化牛奶是降低艰难梭菌在婴儿体内定植可能性的唯一因素。”    根据Kozyrskyj的说法，婴儿的肠道微生物群在早期经历了迅速的变化。因此，了解在这一关键发育时期婴儿肠道中微生物群落的相关因素是至关重要的。

    特应性皮炎（AD，也称为湿疹）是一种常见的慢性炎症性皮肤病。由于患者往往合并其他特异性疾病，比如过敏性鼻炎和哮喘，故被认为是一种系统性疾病。在发达国家，大约10-20%的儿童患有特应性皮炎，我国的AD患病率低于发达国家，不过近十年来增长迅速。    近期的一项研究发现，KIF3A基因中的两个常见变异增加了年幼儿童患特异性皮炎的风险。反过来，这可能使环境因素geng容易穿过皮肤屏障，随着儿童长大而发展成食物过敏和哮喘。    这项研究由美国辛辛那提儿童医院医学中心的研究人员领导，于8月14日发表在《Nature Communications》杂志上。它为特应性皮炎的分子机制研究带来了新的思路，有望确定哪些湿疹儿童geng容易发展成其他过敏性疾病。    之前的研究表明，纤毛结构基因 – 驱动蛋白家族3A（KIF3A）中的遗传变异与特异性皮炎、哮喘等疾病相关。KIF3A编码纤毛组分kinesin-2的一个亚基，是形成初级纤毛所必需的。尽管人们已经重复了这种遗传关联，但对其中的潜在机制还不了解。    疾病相关的KIF3A SNP    研究人员发现，在与特异性皮炎相关的KIF3A SNP中，大约三分之一产生了新的CpG位点。因此，遗传变异与DNA甲基化和CpG位点高度相关。他们将单核苷酸多态性与表观遗传学和基因调控联-系起来。    在这项研究中，研究人员整合了人类和小鼠研究，以解析KIF3A中两种常见的SNP（rs11740584和rs2299007）增加特异性皮炎风险的机制。他们发现，rs11740584和rs2299007风险等位基因会创建新的CpG位点，推测它们可能通过改变甲基化水平来调节KIF3A的表达。    之后，他们招募了携带1个或2个替代等位基因的个体，以及年龄和性别匹配的对照。他们测定了皮肤和鼻粘膜上皮细胞的甲基化水平，发现对照个体的甲基化水平非常低，但携带1个或2个替代等位基因的个体存在不同程度的甲基化。同时，利用等位基因特异性qPCR，他们发现替代等位基因导致KIF3A的表达下调17-19%。    皮肤屏障功能受到破坏    研究人员假设，KIF3A的表观遗传学变化可能与个体的皮肤屏障功能破坏有关。为了解决这个问题，他们评估了反映皮肤屏障功能的经皮水分流失（TEWL）。他们发现，rs11740584和rs2299007位点的甲基化水平与皮肤屏障功能异常有着密切的关联。    为了直接证明Kif3a表达下降导致皮肤屏障功能异常，他们生成了Kif3aK14?/?小鼠，其表皮缺乏Kif3a的表达。与Kif3a+/+对照小鼠相比，Kif3aK14?/?小鼠有着geng高的经皮水分流失，表明皮肤屏障受到破坏。同时，他们还观察到Kif3aK14?/?小鼠皮肤厚度增加，这可能是早期细胞增殖的结果。    研究人员接下来对表皮进行转录组分析，以便深入了解小鼠中观察到的表型。他们对8周大的Kif3a+/+和Kif3aK14?/?小鼠表皮进行RNA测序，发现基底细胞标志物角蛋白5（keratin 5）上调，而粘附连接和紧密连接标志物E-cadherin和claudin-1失调。这些数据支持了Kif3a在皮肤稳态中的作用，Kif3a的缺失导致基底细胞层过度增殖，以及粘附和紧密连接蛋白的定位发生改变，这也许导致经皮水分流失增加。    zui后，研究人员利用烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的皮肤暴露来模拟特应性皮炎。与Kif3a+/+对照小鼠相比，Kif3aK14?/?小鼠在暴露于烟曲霉过敏原后经皮水分流失增加，表皮厚度也明显增加。因此，Kif3aK14?/?小鼠的皮肤屏障受到破坏，在暴露于过敏原后geng容易发展成特应性皮炎的特征。    研究人员之前就发现，肺部组织中的KIF3A功能异常会导致哮喘。同样，肠道组织中KIF3A功能异常会增加食物过敏的风险。如今，这项研究将这两种过敏风险与受损的皮肤屏障相关联，有助于人们geng好地了解皮肤、肠道和肺部健康之间的关系。

    随着人们对健康和疾病防治服务的需求增长，在医疗卫生服务过程中，人们对于诊断试剂质量和安全的意识越来越强。体外诊断试剂可以说是“医生的眼睛”，协助临床医生诊断病情、观察疗效及调整治疗方案等，产品质量和安全水平，是确保相关化验结果和诊断正确的重要基础。    什么是体外诊断试剂    依照我国2014年发布的《体外诊断试剂注册管理办法》，按医疗器械管理的体外诊断试剂（IVD），包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品。可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。    现在，疾病预防、临床诊治基本上都需要用到体外诊断试剂。不管是血尿便三大常规检测，还是病毒、细菌感染的鉴别，或是心肝肾血管、免疫功能检查等，都离不开体外诊断试剂。    体外诊断试剂是如何分类的    根据产品风险程度由低到高，体外诊断试剂分为第一类、第二类、第三类产品。    第一类体外诊断试剂产品，主要包括：    （1）微生物培养基（不用于微生物鉴别和药敏试验）；    （2）样本处理用产品，如溶血剂、稀释液、染色液等。    第二类体外诊断试剂产品，主要包括：    （1）用于蛋白质检测的试剂；    （2）用于糖类检测的试剂；    （3）用于激素检测的试剂；    （4）用于酶类检测的试剂；    （5）用于酯类检测的试剂；    （6）用于维生素检测的试剂；    （7）用于无机离子检测的试剂；    （8）用于药物及药物代谢物检测的试剂；    （9）用于自身抗体检测的试剂；    （10）用于微生物鉴别或者药敏试验的试剂；    （11）用于其他生理、生化或者免疫功能指标检测的试剂。    第三类体外诊断试剂产品，主要包括：    （1）与致病性病原体抗原、抗体以及核酸等检测相关的试剂；    （2）与血型、组织配型相关的试剂；    （3）与人类基因检测相关的试剂；    （4）与遗传性疾病相关的试剂；    （5）与麻醉药品、精神药品、医疗用毒性药品检测相关的试剂；    （6）与治疗药物作用靶点检测相关的试剂;    （7）与肿瘤标志物检测相关的试剂;    （8）与变态反应（过敏原）相关的试剂。    体外诊断试剂都是医疗器械吗？    在我国，大多数体外诊断试剂是按照医疗器械管理的，也有部分体外诊断试剂是按照药品管理的。    按照药品管理的主要是用于血源筛查的体外诊断试剂和采用放射性核素标记的体外诊断试剂，这些产品都不属于医疗器械。    所有上市的体外诊断试剂均应经过食品药品监督管理部门注册或者备案，取得相关医疗器械注册证或者备案凭证。    正规的体外诊断试剂产品是怎样命名的？    体外诊断试剂产品在我国有明确的命名要求，不可以随意命名。体外诊断试剂的命名应当遵循以下原则：    产品名称一般可以由三部分组成。第一部分：被测物质的名称；第二部分：用途，如诊断血清、测定试剂盒、质控品等；第三部分：方法或者原理，如酶联免疫吸附法、胶体金法等，本部分应当在括号中列出。    如果被测物组分较多或者有其他特殊情况，可以采用与产品相关的适应症名称或者其他替代名称。第一类产品和校准品、质控品，依据其预期用途进行命名。    公众对于市场上不符合上述命名原则的相关诊断产品，应及时反映和咨询食品药品监督管理部门，以避免受骗上当。

    牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白，又称第五组分。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生物和机械保护作用和载体作用。    牛血清白蛋白的作用    牛血清白蛋白一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入牛血清白蛋白后，它可能起到保护或载体作用，不少酶类添加牛血清白蛋白后能使其活性大幅度提高。对多数底物牛血清白蛋白而言，牛血清白蛋白可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，牛血清白蛋白可以使酶更加稳定，因为在不含牛血清白蛋白的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10"20min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。    牛血清白蛋白，英文名称为Bovine Serum Albumin，也称Bovine albumin，或Cohn Fraction V，简称BSA。BSA有着极其广泛的实验室应用，在免疫实验中常用作封闭剂，包括ELISA、WB（Western Blot）。作为载体蛋白，将其交联于半抗原和其他弱抗原可以使它们在抗体生产中具有更强的免疫原性。在限制性内切酶消化反应中，BSA常常被用作一些酶的反应稳定剂，并且能防止它粘附到管壁和枪头上。BSA也常用于生物制药的生产过程或者作为营养物用于细胞和微生物培养。除此之外，还作为蛋白定量检测的标准品使用。我们提供的BSA产品，使用优质牛血浆，利用热休克法（Heat Shock）法制备而成。    牛血清白蛋白的成分    血清组成成分虽大部分已为人所知，但还有部分不清楚。在牛血清白蛋白中我们已知的成分大概有以下几种。    1、蛋白质：是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。    2、多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。    3、激素：胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素：促细胞增殖效应。    4、其他成份：氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。    关于牛血清白蛋白的常见问题    1、标准牛血清白蛋白在应用时浓度要适宜,不可太高。牛血清白蛋白组分V最-好现配现用,已经配好的溶液即使是-20度保存一段时间后也会造成你的结果偏高。    2、牛血清白蛋白由热容易凝固，当加热到50°C或以上时，白蛋白相当迅速形成疏水性聚集体，不恢复到冷却后的单体，在某种程度上低温聚合预计也将会发生的,但是在相对较低的利率。    3、天然牛血清白蛋白（BSA）的等电点为4.6~5.8，经无水乙二胺（EDA）和碳化二亚胺（EDC）反应，改性后的牛血清白蛋白等电点为8.6。

1869年的11月第一期《Nature》发表，目前已经满150岁了，因此，杂志特别推出了150周年纪念版，并以“10 extraordinary Nature papers”系列评论性文章点评了最有影响力的10篇文章，接下来仅就其中之一的单克隆抗体发现进行阐述。1975年免疫学家科勒和米尔斯坦在Nature的论文中描述了特异性单克隆抗体的产生，每种单克隆抗体都是通过连续生长的细胞系产生的。他们给小鼠注射了绵羊红细胞和分离的脾细胞，不同的抗体颜色代表不同抗原分子所具有的的特异性抗体，并由不同的细胞产生。他们是想将寿命有限的能够产生抗体的脾细胞与骨髓细胞融合，以便产生永生的免疫细胞，并分泌未知的特异性抗体。这种细胞被称为杂交瘤细胞。不同于未融合的细胞，杂交瘤细胞可以在选择性琼脂平板上生长，并形成相同细胞群落。能产生特异性抗体的杂交瘤细胞能产生噬菌斑。单克隆抗体的发现、杂交瘤细胞技术的出现，让制备任何抗原的抗体成为可能。这篇论文对生物医学，尤其是免疫学研究，产生了巨大的影响。随着抗体可变区和恒定区由不同的基因片段编码理论的提出，当重组细胞将基因片段连接在一起时，对抗体可变区的重组基因片段进行操作时，就会出现不同的抗体。这些机制共同产生了大量特异性抗体以及不同类别的抗体，这些抗体通过其不同的恒定区介导其各种作用。早期，单克隆抗体的生产完全基于杂交瘤技术，随着基因工程技术的完善，制备单克隆抗体的手段也逐渐地多样化，先后出现了噬菌体抗体库技术、单个B细胞技术、天然全人源库技术等。随着单克隆技术的成熟，研究人员对其需求也在不断的丰富，比如鼠单克隆抗体的快速制备、兔单克隆抗体的制备、重组抗体的制备、抗独特型抗体制备、磷酸化抗体定制等。

尽管有了教科书、仪器说明书、产品操作指南和网络教程，但周围仍存在着多种错误的操作步骤，使电泳运行反复出现问题，并导致不适当的结果。迷你系统的相对低分辨率以及短运行时间常常掩盖了这些问题。然而，在大型凝胶的高分辨率双向电泳中，这也是蛋白质组学中最重要的分离方法之一，这些错误的后果会变得更为明显。来自GE Healthcare Life Sciences的Reiner Westermeier博士指出了电泳中常犯的几点错误。1. 聚丙烯酰胺凝胶的交联系数的错误计算聚丙烯酰胺凝胶的孔大小是由两种因素控制的：丙烯酰胺的总浓度T和交联度C： 其中a是丙烯酰胺的质量，以g为单位，b是亚甲基双丙烯酰胺的质量，以g为单位，V是体积，以mL为单位。错误有时候假设给定的丙烯酰胺总浓度T就是单位体积中丙烯酰胺的百分比，而交联系数C就是单位体积中亚甲基双丙烯酰胺的百分比。这导致凝胶中交联剂的含量过高，产生了不透明的凝胶，不但易碎，而且高度疏水。正确的操作根据上面的等式配置溶液，或者使用即用型的丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺储备液，它可从不同的来源购买到。2. 聚丙烯酰胺凝胶的聚合温度和时间丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的聚合通常在30分钟至一小时内发生。然而，在这段时间内，基质的形成并没有结束。所谓的沉默聚合仍在继续，直至完整的基质形成。这一部分的聚合过程需要数小时，并且只在室温（20-25°C）下才能高效开展。错误在有些实验室，聚丙烯酰胺凝胶在冰箱或冷库中聚合，或者在聚合开始后一个或几个小时就已经使用。这可能会造成分离的干扰，尤其是当蛋白必须在天然条件下分离时。并且，若下游必须开展质谱分析，那么未完全聚合的丙烯酰胺单体或寡聚物会在质谱图中产生高的背景噪音。正确的操作让凝胶聚合在室温下过夜进行。如果需要，凝胶可随后储存在冰箱或冷库中。3. SDS样品中产生聚集物单向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品通常须在1-2 % SDS和1 %（w/v）DTT（≈65 mM）或2 %（v/v）β-巯基乙醇（≈350 mM）存在时煮沸几分钟，以实现多肽链的彻底变性和解折叠。错误样品常常在冷却后直接上样到SDS凝胶中。通常还原剂被部分氧化，其中一部分半胱氨酸不受保护，导致重折叠和多肽间聚集物的形成。重折叠形成模糊的区带，有时是两条带。一些聚集物在高分子量区域形成了人为的区带；其他聚集物则过大，无法进入凝胶，在点样孔形成了沉淀聚集。还原剂的过量可能在整个凝胶上40-60 kDa的分子量范围内形成两条或三条水平线。正确的操作煮沸后让样品冷却至60°C左右，然后加入碘乙酰胺。通常我们在100 μl样品中加入10 μl 20%（w/v）的碘乙酰胺水溶液，并在室温下孵育30分钟。通过这一步，我们可以获得更为锐利的条带，并排除了一些假象，如两条带、其他的高分子量条带、点样孔中的沉淀，以及凝胶上的线。4. SDS电泳中运行缓冲液的滴定到目前为止，大部分单向和双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于L?mmli的不连续缓冲液系统中开展的[1]。其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分辨率和重复性不高。在不连续的“L?mmli”系统中，积层胶和分离胶缓冲液是由指定pH值的Tris和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含SDS，运行缓冲液中则包含SDS、Tris和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓慢进入聚丙烯酰胺凝胶，并实现积层效应，产生非常锐利和清晰可辨的区带。错误不幸的是，有一些操作步骤建议将Tris-甘氨酸缓冲液的pH调整至pH 8.3-8.4。这导致上层缓冲液槽中的氯离子载量过高，产生下列影响：分离将比预期时间要长得多，且一些区带不好分辨。因氯离子相对其他所有离子有着非常高的电泳迁移率，所以只有氯离子向阳极方向迁移，直到上层缓冲液槽中没有任何的氯离子剩余。到那时蛋白离子才会开始迁移。在大型的电泳槽中，这需要几个小时至过夜。此外，积层效果也不如理想的不连续缓冲液那样好。正确的操作只使用Tris碱、甘氨酸和SDS作为运行缓冲液。请勿滴定缓冲液，即使它的pH高于9。使用高质量的试剂。参考文献[1] L?mmli , U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680–685.5. 细胞中PBS的不彻底去除在裂解细胞，分离出蛋白进行高分辨率的双向电泳之前，必须用等渗溶液对细胞培养物中的细胞进行高效洗涤。通常使用PBS（磷酸盐缓冲液）。错误PBS溶液有时未能从细胞中彻底去除。这导致样品中的盐污染，致使双向电泳图中出现许多长的水平条纹。正确的操作最后一次洗涤后，必须用移液器彻底吸光细胞中的PBS溶液，一滴也不剩。如果这不太容易做到，我们建议增加一步至三步洗涤，使用250 mM蔗糖和10 mM Tris（pH 7.0）的溶液。6. 双向电泳中IPG胶条的过度聚焦到目前为止，高分辨率的双向电泳为复杂蛋白混合物的分离带来了最-高的分辨率。因此，它是蛋白质组分析中十分常用的方法。理想情况下，生成的双向图显示了所有蛋白的清晰可辨圆点。不幸的是，实际情况却常常不是这样：有时圆点的某些区域模糊，有时形成了水平或垂直条纹，取代了圆点。这些干扰可能有很多原因，过度聚焦就是其中之一。如今在第1向分离即等电聚焦中大多采用了聚丙烯酰胺胶条，它们包含了固定化的pH梯度。由于pH梯度是固定在聚丙烯酰胺基质中的，所以当长期暴露在电场中时它不能散开。然而，过度聚焦会导致双向图像的一些其他干扰，具体会在下文中描述。碱性pH梯度下的蛋白降解当一些蛋白必须在它们的等电点停留一会时，它们不太稳定。实践表明，一些碱性蛋白在它们等电点的pH下对水解特别敏感。这可能导致某些蛋白点延伸出水平条纹。因此碱性IPG胶条的聚焦时间应当限制在最少。“硫脲效应”根据Rabiloud[2]，在提取蛋白和水化IPG胶条时，向尿素中添加硫脲可提高疏水蛋白的溶解度。与只用尿素相比，生成的双向图显示出明显更多的点。然而，在某些情况下，在pH 5.5区域会形成一条很强的垂直条纹，而此条纹酸性一侧的点会比凝胶其他部分的点更加模糊。这种现象可能会观察到，但也并非存在于所有批次的硫脲中。但是它也与应用在IPG胶条上的伏小时相关。如果观察到这种现象，建议降低应用在IPG胶条上的伏小时量。 

单细胞生物学研究一直是当今的热门话题，而且最-前沿的领域就是单细胞RNA测序了（scRNA-seq）。常规RNA测序方法一次性能够对成千上万个细胞进行加工测序，并给出平均差异，但并没有两个细胞是完全一样的，而新型的scRNA-seq方法就能够揭示出制造每一种特异性的微小改变，甚至这种技术还能够阐明完整的新的细胞类型。比如，当来自博德研究所的研究人员Aviv Regev等人利用scRNA-seq对2400个免疫系统细胞进行探查时，他们无意中发现了一些具有潜在T细胞激活活性的树突状细胞，Regev表示，一种刺激这些细胞的疫苗或能够潜在增强机体免疫系统并且保护机体抵御癌症。当然了，这些发现都是来之不易的，相比大量细胞而言，研究人员很难对单个细胞进行操作，因为每一种细胞仅会产生少量的RNA，对于研究者而言没有犯错的余地；另外一个问题就是如何对大量的数据进行分析，最重要的是，研究者使用的工具可能是并不直观的。一般而言，RNA测序数据能够被以指令的形式输入到Unix操作系统中进行分析，数据文件会从一个软件包传输到另外一个，在这个过程中，每个工具都要对每一个步骤进行处理，比如基因组比对、质量控制、识别突变体等等。这个过程是非常复杂的，但对于大量的RNA-seq而言，研究人员可以利用算法对每一个步骤进行处理，而且他们也非常清楚每个过程的运行状况。如今网上有很多在线资源和工具能够简化scRNA-seq数据分析的过程，其中名为GitHub的平台（Awesome Single Cell）就整合了70多种工具和资源，而且相关的工具和资源能够覆盖分析过程的每一步。定制技术在2016年发表的一篇研究报告中，来自夏威夷大学的生物信息学家Lana Garmire就列出了他们进行scRNA-seq数据分析的基本步骤，尽管每一个实验都具有特殊性，但很多分析流程都是按照相同的步骤进行过滤以及对数据进行排序的，同时还能够找出哪些转录物会被表达并且能够纠正扩增效率的差异性，随后研究人员就能够进行一个或多个二级分析来检测亚群和其它功能。研究人员所面临的另外一项挑战就是规模问题，经典的RNA-seq实验往往包含了少量样本，但scRNA-seq研究中则含有成千上万个样本，能够处理少量样本的工具当遭遇十倍甚至百倍的样本时，其效率通常就会降低。比如一种最-常见的单细胞分析类型就是维数约减（dimensionality reduction），这一过程就能够简化数据集来促进对相同细胞的识别；桑格学院研究所的计算机生物学家Martin Hemberg认为，scRNA-seq数据能够把每一个细胞描绘成为“具有20000个基因表达值的一览表”。而诸如主成分分析法（PCA）和t-分布邻域嵌入算法(t-SNE algorithm)等维数约减算法则能够有效地将这些形状投射到两个或三个维度，从而就能够使得相似的细胞聚集在一起。另外一种流行的应用就是伪时分析，2014年研究人员就开发了一种名为Monocle的工具，该工具能够利用机器学习的方法来对scRNA-seq实验性的数据进行推断。当然，诸如Pagoda等其它工具还能够解决亚群特征检测和空间位置确定等信息，其能够利用组织中基因表达的分布数据来确定每一个组织中的转录组学表达情况；来自纽约基因组研究中心的研究者Rahul Satija就开发了一种名为Seurat的工具，该工具能够利用这些数据将细胞定位在三维空间中的点。如今，研究人员已经开发出了一些即用型的检测“流水线”，当然还有一些端对端的图像工具，包括一些商业性的SeqGeq包以及一些成对儿的网络开放性工具，比如Granatum和ASAP（自动的单细胞分析流水线，the Automated Single-cell Analysis Pipeline）；Granatum和ASAP能够利用网-络浏-览器提供相对简单、交互式的工作站来帮助科学家们以图形化的模式来深度分析数据；目前这两个工具能够更好地帮助科学家们进行日常的测序工作。使用工具时需要警惕这些工具并不是在每一种情况下都是完美的，比如一种能够善于精-确鉴别细胞类型的“流水线”或许在进行伪时间分析（pseudo-time analysis）上并不擅长；此外，一些适当的方法或许还具有一定的数据依赖性。对于初学者而言，严谨是非常必要的，生物信息学工具几乎总是能够给出一个答案，那么问题是，这些答案意味着什么呢？来自加利福尼亚大学的研究者Sandrine Dudoit的建议就是进行一些探索性的分析，同时对我们选择的算法进行一些假设性的研究。有些分析性的任务仍然极-具挑战性，包括将来自实验条件下或有机体中的数据同来自不同组学整合的数据进行对比。目前研究人员能够使用足够多的工具来进行研究，而那些对其感兴趣的科学家也在不断钻研；每一种新型工具都能够揭示生物学的另一面，因此只要时刻关注科学，我们就能够做出明确的选择。