实验方法原理：二倍体细胞来源体内二倍体细胞，也即正常细胞的初代培养。初代培养细胞成功后能始终保持二倍体细胞性状，便成为二倍体细胞培养。二倍体细胞虽不难培养，但欲求长期呈旺盛地增殖生长、并保持二倍体细胞性状，亦非易事。为此必须采取一些有效的措施，一是低温冻存，二是妥善的培养方法。用反复传代的方法以求获得大量细胞和维持细胞长期生存的办法是不妥的。因在反复传代中，难免由于培养条件的变化和其它不利影响，使细胞生物学性状发生变化。随时间延长不仅能导致细胞停止生长，并可失掉二倍体性状或发生转化。实验材料：细胞试剂、试剂盒：培养液 BSS 胰蛋白酶 消化液仪器、耗材：培养瓶 实验步骤：二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为1.  吸除旧培养液注入另瓶中；2.  用BSS冲洗1 次；3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用1~5 分钟；4.  待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1）新旧混合；5.  轻轻反复吹打制成单个细胞悬液（消化不足或吹打不充分，易形成细胞团，不利于生长，应注意避免）；6.  按一分为二比例接种培养。其他：1.  采取以下措施可能利于二倍体细胞培养（1）严格控制pH值，zui好在5 %CO2温箱中培养；（2）换液时间不要间隔太长，且不要全部geng新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉1/2或2/3为妥；（3）传代期不能过长，不能让细胞长得过于密集，一旦细胞接近或刚刚连接成片，即进行传代；（4）要选用高质量的培养基和血清，并尽量维持不变，每次传代都按一分为二的原则（细胞数量、营养液量、培养瓶的空间和面积都不得一样）进行培养；（5）传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存。2.  来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂 50 次左右即进入衰退期。不同种类和来源的二倍体细胞生存期都不一样，但生存期皆有限。虽然二倍体细胞具有限的生存期，却完全能满足反复使用的要求。以成纤维细胞为例，即便从初代接种1 个细胞算起，按产生的细胞数=n×2n（n=接种细胞数）计算，它所提供的细胞也近天文数字。而在实际应用上，初代接种的细胞都几十万以上，因此一个二倍体细胞系zui终提供的细胞数量近于无限的。

实验方法原理：本法首-先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。实验材料：血清 血浆 体液试剂、试剂盒：碳酸盐包被缓冲液 抗体球蛋白 吐温 柠檬酸 硫酸仪器、耗材：酶标比色计 96孔板 移液枪 离心管 离心管盒实验步骤：一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。注意事项：1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙-烯、聚乙-烯及聚氯乙-烯等等。但在ELISA中最-常用的是聚苯乙-烯或聚氯乙-烯微量反应板及塑料管。2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。3.对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。4.用最-适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。一般总是要选择那个OD值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清OD值要求5.抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙-烯或聚乙-烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适，但均应通过滴定。

实验概要：了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养基的配制和灭菌方法，掌握植物组织培养的一般方法实验原理（一）植物细胞的全能性  植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。这个概念虽然在本世纪初已经提出，但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。 植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤： 成熟细胞→分生细胞→胚状体→完整植株。  成熟细胞→愈伤组织→出根出芽→完整植株。  脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。 不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。 诱导细胞的脱分化，需要许多外界条件。任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜势，不过它平常处于受抑制的状态，消除抑制作用就可以使细胞恢复分裂。在各种外界条件中，外源激素对脱分化起重要作用。有些植物的外植体仅需加入生长素（IAA"吲哚乙酸"，NAA"萘乙酸"，2，4-D）即可诱导细胞的分裂与生长，如菊苣；有的仅需加入加细胞激动素类，如大豆、萝卜；另一类需加生长素和细胞激动素类，如烟草髓、胡萝卜、马铃薯；还有一类不需加任何激素，如冠瘿组织，烟草肿瘤组织。（二）组织的分化与器官建成  外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织（meristemoid）即具有分生能较往年小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。所以器官发生有两种方式，即直接和间接的。  （1）外植体→器官发生（根、芽或胚状体）→再生植株。 （2）外植体→愈伤组织→类分生组织→根、芽→再生植株。 根是组织培养中易形成的器官，形成芽的培养基条件常有不同，有时芽与根可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。 （三）培养基的组成 培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最-佳条件相近似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。1、无机营养：矿质元素（矿物质）对植物的生命非常重要。例如：Ca是细胞壁的组成成分；氮是氨基酸、蛋白质、核酸和维生素的重要组成成分；镁是叶绿素的组成成分；铁、锌和钼是某些酶的组成成分。除了C、H、N、O外，还有12种其他元素是植物生长所必需的。植物对元素的需求浓度大于0.5mol/L时，这些元素称为大量元素；而需求浓度小于0.5mol/L的元素则成为微量元素。和一般植物对元素的需求一样，多种盐能满足组织培养对微量元素和大量元素的需求。N、K、P、Ca、S、Mg为大量元素。必需的微量元素有Fe、Mn、B、Cu、Zn、I、Mo、Co，植物对这些元素的需求量为微摩尔每升数量级。为了获得最大的生长速度，每种营养成分的最-佳浓度可以有相当大的变化。当矿物盐溶解在水中时，他们被解离。培养基中的活化因子是不同种类的离子，而不是化合物。因此，通过对培养基中不同种类离子浓度的测定，就可以对两种培养基做出比较。在大多数情况下，一种营养培养基所含的无机氮在25~60mmol/L之间。细胞能够在硝酸盐单独存在的情况下生长，但是在更多的情况下，铵或者其他还原态氮对植物的生长又明显的好处。另外，当培养基中仅含硝酸盐时，pH会升高。当培养基中同时含有硝酸盐和少量的铵化合物时，pH的这种变化就会被抑制。硝酸盐和铵的应用范围分别在25~40mmol/L和2~20mmol/L。对铵的响应得变化从抑制到必需依赖于组织类型和培养目的。在铵的量超过8mmol/L的情况下，或者组织生长在仅含这种氮素的培养基中时，培养液中也应该含有柠檬酸盐、苹果酸、琥珀酸或者其他TCA循环中的酸。大多数植物选择硝酸盐而不是铵，相反的情况也存在于另外一些植物中。钾的需要浓度为2~26mmol/L，钾一般以硝酸盐或氯化物的形式提供，钠不能代替钾。浓度为1~3mmol/L的Ca、硫酸盐、磷酸盐和Mg通常能满足要求。培养基中的Fe通常以螯合物的形式加入，当pH达到8时，这种形式的Fe仍可利用。2、碳源和能源：没有例外，标准碳源是蔗糖或葡萄糖。果糖也可以作为碳源，但是效果要差一些。培养基中的蔗糖可以迅速地转化为葡萄糖和果糖。葡萄糖首先被利用，然后是果糖。培养基中的蔗糖浓度一般为2%~5%。其他的碳水化合物，包括乳糖、麦芽糖、半乳糖和淀粉也被使用做碳源，但是这下化合物的效果一般比蔗糖和葡萄糖差。大多数培养基含肌醇，其浓度约为100mg/L。肌醇可以改善细胞的生长。3、维生素：正常植物（相对离体植物而言）可以合成其生长和发育所需要的维生素。但是，植物细胞的体外培养需要在培养基中加入维生素。维生素B1是植物生长和发育所必需的。烟酸和维生素B6可以改善细胞或离体植物的生长。一些培养基中含泛酸、生物素、叶酸、对氨基-苯甲-酸、氯化胆碱、核黄素和抗坏血酸。4、生长调节剂：激素是高等植物合成的有机化合物，它们影响植物的生长和发育。植物激素的量很小，而且通常在产生它们的部位以外的地方作用。除了自然化合物，人们还合成了与自然激素相同的化合物。所有这些激素统称为生长调节剂。主要的生长调节剂有两类，它们在职务组织培养中具有特殊的重要性： ⑴生长素   生长素的共同特点是它们具有能导致细胞分裂和形成愈伤组织的性质。生长素引起细胞分裂、细胞生长和组织增大及不定根的形成。它经常抑制不定芽和腋芽的形成。当生长素的浓度较低时，不定根的形成占主导地位，然而，当生长素的浓度较高时，愈伤组织能够形成，而根不能够形成。最-常用的高效化合物是2，4—二氯-苯氧乙酸（2，4—T）。其他可以使用的生长素是萘乙酸（NAA）、吲哚丁-酸（IBA）、2，4，5—三氯-苯氧乙酸（2，4，5—T）、对氯-苯氧乙酸（pCPA）和毒莠定。 ⑵细胞分裂素   细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，它对诱导芽的产生具有重要作用。最-常用的细胞分裂素有激动素、苯甲基嘌呤（BA）或6—苄氨基嘌呤（BAP）、玉米素和异戊烯基嘌呤（2iP）。这些化合物通常被用于刺激植物生长和发育。当把它们和生长素一起使用时，通常可以促进细胞分裂，高浓度的（1~10mg/L）时可以诱导不定芽的形成，但是根的形成一般被抑制。它们通过降低顶端优势促进侧芽的形成。 ⑶其他激素  赤霉素通常被用于植株的再生。一般情况下，赤霉素可以使节间生长、引起离体分生组织或芽的生长。赤霉素通常抑制不定根和不定芽的形成。 脱落酸是诱导胚形成的一个重要的生长调节剂。5、有机添加剂：培养的正常细胞能够合成其所需要的所有氨基酸，但是，当其中含有氨基酸（如谷氨酸）形式的有机氮和核苷酸存在时是有益的。外加氨基酸要慎重，因为这些氨基酸可能成为抑制剂。6、胶凝剂：琼脂是一种最-常用的凝固剂，它在组织培养中作为支撑物。琼脂的浓度过低，与水的亲和力不强，难以形成有效的支撑；琼脂的浓度过高，培养基就会变硬，妨碍营养向组织中扩散，离体生长将受到负面影响。 有支撑物的液体培养基可以取代固体培养基： ①不含琼脂的液体培养基，以干净的泡沫塑料、玻璃纤维为支撑物 ②悬挂在液体培养基中的过滤纸桥 ③生长在有玻璃珠的液体培养基中 ④位于滤纸下的纤维胶海绵代替琼脂作为液体培养基的载体7、pH：pH决定着生物大分子的结构和活性的许多方面。对于外植体的离体培养，合适的营养培养基的pH值为5.0~6.0。一般情况下，pH﹥7.0或pH﹤4.5时，生长和发育停止。培养基的pH在消毒前和消毒后不相同，一般情况下，经过高压消毒后的培养基，其pH值回降低0.3~0.5。pH﹥6.0时，可以得到硬度合适的培养基，而pH﹤5.0时，琼脂就不能形成令人满意的凝胶。主要试剂详见实验步骤。主要设备镊子、解剖刀、培养皿、 苗瓶、 酒精瓶、  超净工作台、三角瓶、电炉等；实验材料种苗（ 从分生部上沿切取一段约25px左右的种苗茎，切好的外植体上应保留一片苗叶，若叶片上有萎黄部位，切除之），详见实验步骤。实验步骤1、向烧杯中顺序加入培养基母液： 大量元素 25ml    微量元素 2.5ml    铁盐 2.5ml    维生素、肌醇和甘氨酸各2.5ml    BA和NAA各2.0ml  2、加入实际配制培养基体积约2/3－3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖和3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水准确稀释至500ml，继续加热几分钟使之混合后分装于10个100ml三角瓶中，以封口膜封口，用记号笔写上学号和姓名。 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2,灭菌时间20min左右，灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。  3、将超净工作台用75%的酒精擦拭一遍，实验中需要用到的器具（镊子、解剖刀、培养皿）和装培养基的三角瓶也用75%的酒精擦拭一遍后置于超净工作台中。打开紫外灯和风机，处理20-30分钟。  4、双手用肥皂洗净，再用75%酒精擦拭一遍后，连同用75%酒精擦拭过的种苗瓶一起进入超净工作台。进入超净工作台后，不得随意出入，以免染菌。实验过程中应尽量避免手直接接触。  5、点燃酒精灯，将镊子和解剖刀在灯焰上烘烤后，插在酒精瓶中；在灯焰附近打开种苗瓶封口，从酒精瓶中取出镊子和解剖刀，灯焰上烘烤后切取种苗于培养皿，使用过的镊子和解剖刀放回酒精瓶（实验中使用镊子和解剖刀前均需在灯焰上烘烤灭菌，使用完后放回酒精瓶；在接种时，镊子应尽量多烘烤一段，以防镊子插入过深时，致使培养物染菌）；瓶口和封口膜内侧灯焰上烘烤后封口；实验过程中应尽量避免手直接接触外植体材料。  6、从分生部上沿切取一段约25px左右的种苗茎，切好的外植体上应保留一片苗叶，若叶片上有萎黄部位，切除之。  7、在灯焰附近打开培养基瓶封口，接种过程中，培养基瓶口应一直对准灯焰，手不得接触封口膜内侧；将切好的外植体材料垂直插入培养基中，一瓶接种1-2个。此过程应尽快完成后封口。  8、接种好的三角瓶24℃培养。2天后观察，若有染菌需重做。一周后愈伤组织可形成。继续分两组培养：一组24℃光照培养，另一组24℃黑暗环境下培养，观察两组培养物再分化情况。

实验方法原理：干粉型培养基是用球磨机或喷雾法将各种培养液成分混合后制成，具有性质稳定、便于贮存和运输、使用方法简便等优点。具有维持细胞生存和代谢需要的效果，与传统方式制备的合成培养基一样好。干粉培养基因颗粒极细，很容易完全溶解于水，配制培养液方法极易掌握，只要按照说明书将规定重量的干粉溶解在一定量的水中即可；或按比例配制，经过消毒灭菌后即使用。实验材料： 干粉试剂、试剂盒：蒸馏水 NaHCO3 HCl NaOH仪器、耗材：滤膜实验步骤： 用干粉制备培养液的过程如下1.  制备出去离子水（玻璃三蒸馏水）；2.  加温水至15—30 ℃；3.  把干粉加入水中，搅拌令之溶解；4.  加NaHCO3；5.  加水至最终量；6.  必要时用1N HCl 或1N NaOH 调节pH；因滤过的pH 可能受影响；7.  用0.22 μm 或小于此微孔滤膜滤过消毒。注意事项： 1.  不同厂家生产的同种产品其成分比例可能不全相同，配制方法也不同。2.  有的培养基需加热或通气来帮助溶解，此外还应注意有的培养基成分不完全，要求另外加入补充成分。3.  如谷氨酰胺就是时常再单独加入的成分。另外一般都不含NaHCO3 成分，也需配制时自行加入。4.  但总的原则是配制过程中要使每一种成分都必须充分溶解和避免出现沉淀。5.  所以在配制培养液时，要按照各种成分的性质、分成若干组分个别溶解，最后按比例和一定顺序混合。6.  掌握1—2 种粉剂的配法即可，其它大同小异。

实验材料：大清叶 板蓝根 连翘 拳参 试剂、试剂盒：纯化水 乙醇 蔗糖粉 糊精仪器、耗材：烧杯 玻璃棒 天平 旋蒸仪 圆底烧瓶 桑皮纸 实验步骤：一、准备1.  原辅料的处理: 根据药材的有效成分不同，可采用不同的溶剂和方法进行提取，一般多用煎煮法提取有效成分，用等量乙醇精制时放置的时间、回收乙醇后放置的时间可根据实验安排情况，适当延长，以沉淀完全，上清液易于分离为宜。2.  制颗粒：掌握湿法制粒的操作方法。控制清膏的相对密度时由于生产量较小，不方便用比重计测量，也可用桑皮纸上测水印的方法适当掌握，以不出现、或仅有少量水印为度；加辅料的量一般不超过清膏量的5倍，以手握之成团，触之即散即可；如果软材不易分散，可用乙醇调整干湿度，以降低黏性，易于过筛，并使得颗粒易于干燥。3.  干燥与整粒：湿颗粒立即在60～80 ℃常压干燥。整粒后将芳香挥发性物质、对湿热不稳定的药物加到干颗粒中。4.  颗粒剂易吸潮变质，为保证颗粒剂质量，应选择适宜的包装材料进行包装。二、具体操作将大清叶，板蓝根，连翘，拳参四味，加纯化水煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.08（90～95 ℃），待冷至室温，加等量的乙醇使沉淀，静置；取上清液浓缩至相对密度1.20（60～65 ℃），加等量的水，搅拌，静置8小时，取上清液浓缩成相对密度为1.38～1.40（60～65 ℃）的清膏。取清膏1份、蔗糖粉3份、糊精1.25份及乙醇适量，制成颗粒，干燥，即得。注意事项：1.  为使成品纯净，提取液浓缩至相对密度约为1.08加等量的乙醇使沉淀，以除去树胶，蛋白等杂质，同时便于制粒。2.  制备的糖粉需600 °C干燥，除去结晶水。

 一直以来，科学家们都知道细胞重编程可以逆转衰老，从而导致间充质干/基质细胞（MSCs）的活动和功能下降。但是他们尚未弄清楚是什么分子机制导致了这种逆转。最新一项研究解答了这个谜题，不仅提出了关于MSC衰老和相关疾病的新见解，而且也为开发减少或逆转衰老过程的药理策略提供了帮助。这一研究发现公布在STEM CELLS杂志上。由威斯康星大学麦迪逊分校的科学家组成的研究小组利用细胞重编程（一种通常用于逆转细胞衰老的方法）建立了遗传上相同的新老细胞模型。首席研究员Wan-Ju Li博士解释说：“虽然与以前通过细胞重编程使MSC再生的发现相一致，但我们的研究进一步揭示了如何通过分子调控重编程的MSC来改善细胞衰老的标志。”研究人员首先从人关节液（SF-MSC）（即在膝盖，肘部和其他关节中发现的液体）中提取MSC，然后将它们重新编程为诱导多能干细胞（iPSC）。然后，将这些iPSC还原为MSC，从而使MSC焕发了青春。李博士说：“当我们将重编程的MSC与未恢复活力的亲本MSC进行比较时，我们发现与亲本相比，重编程的MSC的衰老相关活性大大降低。这表明细胞衰老的逆转。”接下来，研究小组对细胞进行了分析，确定重编程是否导致整体基因表达发生变化。结果发现，与对照细胞相比，在重编程的细胞中GATA6的表达受到抑制，这是一种在肠道，肺和心脏发育中起重要作用的蛋白质。这种抑制作用导致称为SHH（Sonic Hedgehog）的胚胎发育所必需的一种蛋白质的活性增加，以及另一种蛋白质FOXP1的表达水平增加，后者是大脑，心脏和肺部正常发育所必需的。“因此，我们确定了GATA6/SHH/FOXP1途径是调节MSC衰老和恢复活力的关键机制。”“在控制MSC老化中发现了GATA6/SHH/FOXP1途径是一项非常重要的成就。” STEM CELLS主编Jan Nolta博士说，“过早的衰老会阻碍这些有希望的细胞扩增的能力，同时又保持其临床用途，这对控制分化和衰老的途径也非常有价值。”为了确定哪些Yamanaka转录因子（用于衍生iPSC的四个重编程基因）参与了iPSC中GATA6的阻遏，研究小组分析了GATA6的表达。由此发现只有OCT4和KLF4能够调节GATA6活性，这一发现与之前的几项研究一致。“总体而言，我们能够证明SF-MSC由于细胞重编程而经历了性质和功能的重大变化。iPSC-MSC的这些变化共同表明细胞衰老得到改善。最重要的是，我们能够鉴定出GATA6/SHH/FOXP1信号通路是控制细胞衰老相关活动的潜在机制。”李博士说。“我们相信我们的发现将有助于增进对MSC衰老及其在再生医学中意义的更深一步了解。”

蒙大拿大学的研究人员在《Science》发表了关于细菌如何引起感染的新见解，可能有助于未来的抗感染治疗。 研究对象不是细菌，而是感染病毒的噬菌体，作为国家卫生研究院资助项目的一部分，帮助开发细菌感染疫苗。“噬菌体通常被视为细菌寄生虫，”该论文的合着者助理教授Patrick Secor说。由于耐抗生素的细菌流行率越来越高，利用噬菌体（噬菌体疗法）替代抗生素杀死致病细菌的研究逐渐升温。噬菌体多种多样，被认为是地球上最普遍的生物实体。“当我们寻找感染致病菌铜绿假单胞菌的噬菌体时，我们发现大多数菌株都感染了一种名为Pf的噬菌体，但这种噬菌体不会杀死它们的细菌宿主，”Secor说。当Secor和斯坦福大学的研究人员在人体伤口中寻找Pf噬菌体时，他们惊讶地发现了大量丝状噬菌体——平均每个拭子上有100万个Pf噬菌体。Secor课题组以前研究过噬菌体是如何影响细菌毒性的。“因此，我们问，这些Pf噬菌体是否可能直接与人体免疫系统相互作用？”他们与斯坦福大学的合作者一起发现，Pf噬菌体被免疫细胞识别为了病毒，识别冷病毒的细胞表面受体同样也可以识别噬菌体。“这是一个关键的发现，”Secor说。“这些噬菌体诱导了抗病毒反应，但是面对细菌感染，这是一种不适当的免疫反应。”研究人员认为，这种不适当的免疫反应使细菌在伤口或肺内获得“掩护”，从而建立感染。研究人员希望，他们的发现可以刺激新研究，通过靶向感染细菌的噬菌体发展控制感染的有效策略。

一、 固定化微生物以与固定化酶相同的固定方法将酶活力强的微生物体固定在载体上，微生物体本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。有死细胞固定化和生长细胞固定化两种。二、 固定化微生物的特性固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好、稳定、降解有机物性能力强、耐毒、抗杂菌、耐冲击负荷。将固定化微生物制备成颗粒状、膜状和包埋制成凝胶，充填到反应器中用于连续流运行，微生物不会流失。三、 固定化微生物的固定方法固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法、逆胶束酶反应系统和孔网状载体截陷固定技术。1、 载体结合法。以共价结合、离子结合和物理吸附等将微生物固定在非水溶性的载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。在污水处理中，这种固定方式要求生物膜载体表面具某种活性基团，通常可对载体表面进行改性，达到携带活性基的目的。2、 交联法将微生物与2个或2个以上的官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醇、双重氮联苯胺和六亚甲基二异氰酸酯。细胞间自交联是自然界普遍存在的一种现象，如活性污泥系统中菌胶团的形成以及厌氧污泥床中颗粒污泥的产生均是通过细胞间自交联实现的。为了进一步强化细胞间或酶间的这种自交联程度，可以认为的加入一些交联剂形成细胞间的稳固结合。交联剂在活性污泥系统中也有应用，有时认为地向曝气池内投加一定量的交联剂能得到更好的菌胶团，它有利于二沉池中泥水分离及有助于控制曝气池内微生物浓度。同时可以查看中国污水处理工程网更多技术文档。3、 包埋法。将微生物包埋在凝胶微小格子中，或者将微生物包裹在半透性的聚合物膜内的固定方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺（PACAM）凝胶、聚乙烯醇（PVA）、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料有尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。包埋技术是通过某些多聚体化合物包裹微生物，从而达到固定微生物的目的。它有两大特点，一是可快速、简捷地获得固定微生物；二是可以选择性地同时固定不同菌属的微生物。目前，该种技术在文献中已有大量报道，特别是在生物工程领域。由于研究目的的不同，所选用的多聚体包埋剂也不尽相同。在污水生物处理中，人们应用较多的包埋剂为PVA及海藻酸等。经过多聚体包埋处理后的微生物分别于多聚体骨架内，可以将它们制成颗粒或方块状等不同形状的材料。值得强调的是，多聚体在包埋处理了微生物后，一般其机械强度不够理想，加之微生物在包埋体的增长，使的包埋体的破损率较高。这些无疑在一定程度上限制了多聚体包埋技术在污水生物处理中的大规模应用。

由于牛血清白蛋白(BSA)具有多种产品样式，可满足不同种的应用。目前网上的信息大多模棱两可，有牛血清白蛋白，也有牛血清白蛋白v组分等，很多 供货商对其区别也是不清楚的；另外，市场上还提供无蛋白酶、无DNase及无RNase、无脂肪酸、微生物级、试剂级、诊断分析级等不同等BSA粉末，因 此如何选择合适的BSA产品是很重要的前提。一般来说，普通的BSA粉末或者第五组分适合于细胞和组织培养，也可以用于一些蛋白补充物；而其它无蛋白酶、 无DNase及无RNase、无脂肪酸等处理的BSA则适合于更多的免疫学、蛋白学等应用，作为封闭剂、蛋白Marker、半抗原载体以及蛋白稳定剂等。 下面做一下简单的介绍：标准级BSA经热处理的普通BSA产品，可作为组织细胞（微生物、动物及昆虫细胞等）培养养料和培养成分以及蛋白分子量标准组份，为性价比较高的BSA产品，如EquiTech-Bio的BAH62系列产品。BSA第五组分BSA第五组分较普通的BSA纯度更高。BSA第五组分使用Cohn方法纯化而来，是生物技术级的产品，一般可用于细胞培养，也可作为半抗原载体、保护剂以及蛋白补充物对照等。如EquiTech-Bio的BAC62或BAC63系列产品。无IgG试剂级BSA试剂纯级BSA比BSA第五组分具有更好的纯度，该粉末中不含有可能会干扰分析的球蛋白IgG成分。可作为组织细胞培养养料和培养成分以及蛋白分子量标准组份。如EquiTech-Bio的BAH64系列产品。无蛋白酶BSA无蛋白酶的牛血清白蛋白可用于细胞培养生产蛋白实验，尤其适用于表达对蛋白酶活性敏感的蛋白。另外无蛋白酶的牛血清白蛋白也非常适合。如EquiTech-Bio的BAH67系列BSA产品和BAC65系列第五组分产品。无脂肪酸BSA无脂肪酸BSA可用于脂肪代谢相关分析的载体蛋白，也可与某种特异性的脂肪酸结合以形成白蛋白，可应用于增强细胞培养体系的性能；若实验中脂肪或脂肪酸的存在影响激素或者胆固醇的读数时，这个产品是首-选。如EquiTech-Bio的BAH66系列。低内毒素BSA低内毒素牛血清白蛋白是细胞和组织培养非常理想的选择。可作为无血清和合成培养基营养补充剂的载体，另外作为实验室的一般试剂用来稳定和稀释敏感 蛋白溶液，也可以作为诊断、分析工具，如ELISA。如EquiTech-Bio的BAH系列，内毒素含量低于1.0 EU/mg。无蛋白酶/IgG BSA不含有蛋白酶以及RNase酶活性，同时不含IgG，纯度等级更高，作为稀释液或封闭液应用于EIA和ELISA等试验中。如Jackson的001-000-16X系列以及EquiTech-Bio的BAH67（无蛋白酶/IgG，也不含RNase）系列产品。诊断级BSA诊断级牛血清白蛋白-粉末是专门用于减少可能会产生背景干扰以及细胞培养体系抑制等因素，不含蛋白酶、生物负载以及IgG，具有很低活性的内毒素 （低于3.0 EU/mg）。可用于蛋白标准品、稀释剂、偶联物或者酶稳定剂，也可以应用于高灵敏度的免疫分析实验、细胞培养以及杂交实验等。如EquiTech- Bio的BAH68系列产品。

在Western Blot过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个 Western Blot参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精-确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙：一. 未染色（pre mixed）蛋白分子量标准未染色的蛋白分子量标准是最-简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精-确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条！数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最-好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker（pre-stained）好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。① 宽分子量蛋白标准如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。② 高分子量蛋白标准通常在检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，③ 低分子量蛋白标准在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。二.预染蛋白分子量标准预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最-佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最-佳分辨区时停止电泳以得到最-佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精-确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。如果沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些！单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最-高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的着名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。 选择BLAST程序，可与数据库相配比。 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。3 与质谱（mass spectrometry）相关的技术质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器（ion reflectron）和延迟提取（delayed ion extraction），可达相当精确的分子量。 在ESI-MS中，纳米级电雾源（nano-electrospray source）的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱（tandem MS）联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。 甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最-常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠-军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay， PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。 因此，允许推断肽片段序列。肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。 首先进行肽质指纹鉴定。 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 但经常产生不完全的片段。 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。 由此，序列可被推测。 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。4 氨基酸组分分析1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。 Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在155℃进行酸性水解1 h，通过这一简单步骤的氨基酸的提取，每一样品的氨基酸在40min内自动衍生并由色谱分离，常规分析为100个蛋白质/周。依据代表两组分间数目差异的分数，对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠-军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分，考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异，仅处于冠-军的蛋白质的可信度大。 Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质。 但仍存在一些缺点，如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异。 故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。

　　我们知道对照品是指国家药品标准中，用于鉴别、含量测定和有关物质检查等等的标准物质，是不可缺少的重要组成部分和专用量具，是研发生产中测量药品的质量的基本标准；当然对照品也是校正测试仪器及方法的物质标准。标准品是中药标准对照品研究中心代理的，用来作为一种衡量标准，用作药物方面，则为含量测定中的标准含量。标准品包括化学计量标准品、冶金标准品和药检标准品。　　标准品现目前在中国药品生物制品检定所已能提供各类国家标准物质有2930种，中药化学对照品有650种，对照药材有730种。　　对照品能提供的各类国家标准物质有1243种，中药化学对照品有288种，对照药材有400种，两者占总数的一半以上。　　对照品指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，而标准品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。文献中常将2种概念混淆，认为对照品就是标准品，是1种物质2种提法而已，造成错误的原因，可能是有的药品既有对照品，又有标准品。　　标准品指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。国家标准品及生物参考品系指用于鉴别、检查含量或效价测定的标准物质，其制备与标定应符合“生物制品国家标准物质制备和标定规程”要求，并由国-务院药品监督管理部门指定的机构分发。企业工作标准品或参考品必须经国家标准品或参考品标化后方能使。　　标准品和对照品均附有使用说明书，质量要求，有效期和装量等。生物制品标准物质系指用于生物制品效价、活性或含量测定的或其特性鉴别、检查的生物标准品或生物参考物质。　　对照品或标准品混用，即将对照品或标准品用于不是其标定方法的含量测定，是药品检验中经常出现但未引起重视的一个问题。尽管同一批对照品不同标定方法的含量有很好的相关性，但并不完全相同，有时差别会很大。如英国Glaxo公司提供的头孢呋肟酯对照品，HPLC标定为96.9%，供含量测定用；UV为98.8%，供溶出度测定。虽然中国药典凡例明确规定卫生部所发对照品仅用于正文中所规定的分析方法。

　　来自台湾和越南的研究人员研究了山茱G是否能改善链脲佐菌素诱发的糖尿病引起的急性肝损伤。他们的研究结果发表在《BMC补充和替代医学》杂志上。　　G. tenuifolia(香菊)在台湾澎湖岛被用来制作传统凉茶。由于其具有解热，保肝和抗炎的特性，当地居民也将其用作民间药。　　为了测试其保护肝脏免受损害的能力，研究人员用高脂饮食喂养大鼠，并给它们注射链脲佐菌素-烟酰胺(STZ-NA)来诱导高血糖症。　　然后，他们在饮用水中给大鼠低剂量或高剂量的藤黄提取物或抗糖尿病药，持续四个星期。　　研究人员报告说，STZ-NA增加了以下内容：　　肝肿大　　肝细胞横截面积　　肥大相关途径(IL6 / STAT3-MEK5-ERK5，NFATc3，p38和JNK MAPK)　　促凋亡分子(细胞色素C，裂解的caspase-3)的表达　　纤维化相关途径(FGF-2，pERK1 / 2)的激活　　他们还发现，用低剂量或高剂量的ten.folia提取物可以降低这些途径成分的表达。　　研究人员将藤黄假单胞菌的肝脏保护作用归因于其增强补偿性PI3K-Akt和Bcl2存活相关途径的激活的能力

在医学日渐发达的今天，我们常常看到干细胞救治疑难杂症患者，很多名人政要用干细胞抗衰老，相信很多人对干细胞这个名词已不陌生。但依旧有很多人不太了解这是什么？能干什么？甚至还有很多人把各种干细胞混为一谈，甚至提到造血干细胞就认为是人体内的“骨髓”，小编针对大家最需了解的常识问题进行答疑。1、什么是干细胞？干细胞存在于人体哪些地方？What are stem cells干细胞是具有自我复制、多向分化和归巢潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的始祖细胞。如同一棵树干，可以长出树杈、树叶、开花和结果一样。现如今科学家已经成功从许多器官或组织中分离出了干细胞，其中包括视网膜干细胞、胰腺干细胞、成骨干细胞等。研究表明，干细胞不仅存在于胚胎，而且存在于成人体内，可以从脐血、脐带、胎盘、骨髓、脂肪、血液等组织中分离出相应的干细胞。2、干细胞从何而来？Stem cells come from在细胞分化的过程中，由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞，直至完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，使这保持了亲代的特性。这部分被保留下来的未分化的原始细胞，称为干细胞，一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化的细胞。3、干细胞的特性？Characteristics■ 干细胞的特性（1）无限增殖分裂；（2）干细胞可连续分裂几代，也可以长时间的处于静息状态；（3）受体内信号调控；（4）干细胞分裂产生的两种途径：分化具有分化能力的细胞，仍保持亲代特征，作为干细胞待命；不可逆地向终末分化，失去分化能力，最终衰老死亡。4、干细胞的任务是什么？The task of stem cells干细胞的任务，就是透过它可以无限量复制的特性，大量的产生工作细胞，使人体器官能够正常工作。科学家们总结干细胞的五大任务，简称为5R：Replace 替代或补充Repair 修补或修复Regenerate 组织及器官的再生Restore 生命功能的恢复或复原Regress 癌细胞的退化理论上，如果5R可以正常运作，身体就可以不生病、不老化，甚至不死亡。5、干细胞对于人体有哪些作用？The role of stem cells（1）増强身体的免疫系统、调整生长因子指数、促进伤口快速愈合避免疤痕；（2）促进器官组织细胞新生，使器官年轻化，延缓器官衰老；（3）提高睡眠质量，改善亚健康；（4）保护肝脏，治疗肝纤维化、肝硬化；（5）促进新陈代谢；（6）增强体能和精力，令机体活力充沛；（7）促进心肌细胞生长、增进心脏功能耐力、预防心脏病及中风；（8）稳定血压、平衡胆固醇；（9）改善皮肤及问题性皮肤，恢复皮肤光泽、光滑与弹性、减少皱纹，使面部年轻化；（10）能够增强性能力、提高性-生活质量（11）提高运动系统能力，改善骨质疏松，腰腿疼痛的状况（12）恢复神经系统功能，增进记忆力，预防帕金森，老年痴呆等。6、衰老的原因和表现？Causes and manifestations of aging（1） 人体衰老，皱纹的出现，根本原因是细胞的衰老和减少，而这基本是由干细胞衰老引起的。（2）光滑、润泽和弹性皮肤的核心是胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸。前两者与皮肤厚度和弹性有关，而后者与皮肤水分含量密切相关，胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸是由皮肤中的细胞合成的。一旦细胞的活力降低，这些合成就会减少，皮肤变得无弹性、无水分，松弛、干燥。（3）干细胞作为用于替代各种组织细胞的种子细胞，是人细胞的生产产物。干细胞群的老化严重削弱了它们的增殖和分化能力。（4）新细胞的补充能力不足，老化细胞不能及时更换，导致全身功能下降，人们每天都在变老。而你的皮肤，由于皮肤干细胞的老化无法及时更新，细胞不能合成足够的胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸，皮肤慢慢开始衰老，所以你有皱纹、斑点等，逐渐失去青春。7、为什么干细胞疗法可以抗衰老？Stem cell therapy anti-aging在人一生的整个生命活动中，机体细胞时刻处于新生细胞替代衰老退化细胞的过程中，当细胞更新速度小于细胞衰老速度时，产生更新不足，机体就会出现衰老。表现为全身系统功能下降，代谢缓慢，外观衰老状态的出现。机体内能够起到更新作用的细胞就是干细胞，而衰老的源头就是干细胞数量的不足。干细胞移植疗法，就是为机体补充缺乏的干细胞，帮助机体快速更新替换衰老的细胞，从而使机体年轻充满活力。8、抗衰和干细胞数量有什么关系？Anti-aging and stem cell count人在刚出生时，人体体细胞数有3万亿左右。其中干细胞约有60亿，这是一生中干细胞数量最多的时候，也是生长最-快的时候。随着年龄的增长，干细胞数量开始下降。到25岁时，人体的体细胞数已经达到60万亿左右，而干细胞数量仅有约10亿，人体停止生长，开始逐渐衰老。到50岁时，体细胞数依旧是60万亿左右，但是干细胞数量仅剩下约3亿，人体衰老加速。各器官功能下降，重大疾病发病率提升，所以人体衰老与干细胞数量有直接关系。9、干细胞用于抗衰有什么作用？Anti-aging effect of stem cells■ 改善皮肤干细胞可以迁移到表皮，转变为皮肤干细胞 ，一个早期的皮肤干细胞可以产生400万个表皮细胞，为皮肤系统的细胞更新提供了充足和良好的来源。新生的细胞代谢能力强，代谢废物排出及时，不会让色素在皮肤中沉积，因而抑制和减少色斑的形成。新分化出的年轻细胞保水性好，足以使衰老的皮肤恢复细腻光滑。同时，合成大量胶原蛋白与弹性纤维 ，恢复塌陷的网状结构，恢复皮肤弹性，减少皱纹的产生，从根本上改善皮肤系统的质量。■ 纤体瘦身通过体外培养后再回输到人体的干细胞，可以改善体内细胞的状态更新，进而增强细胞活性，提高机体对脂肪的代谢能力，减少细胞中的脂肪含量，缩小脂肪细胞的体积，明显降低体重，从而达到纤体瘦身的效果，并且有效降低血液中总胆固醇和甘油三酯的浓度，有预防疾病发生的作用。■ 维护卵巢干细胞随着血液循环迁移到卵巢，随之分化产生足量的新生卵巢细胞，补充卵巢细胞数量，维持卵巢的正常形态，从而防止卵巢萎缩变形。另外，新生的卵巢细胞可以对脑垂体促性腺激素作出及时、正确的反应，分泌足量的雌性激素，使体内激素水平处于平衡状态。回输的干细胞，可以改善女性因为卵巢功能衰退而带来的各种困扰，消除更年期的各种不适症状，使提前绝经或正常绝经不久的女性恢复月经，推迟更年期，从而抑制衰老，使女性朋友重获青春健康之美。10、什么是干细胞技术？What is stem cell technology干细胞技术，是指通过对干细胞进行体外培养，分离、纯化、扩增及定向诱导等过程，在体外繁育出全新的、正常的、甚至更年轻的细胞，并最终回输到人体以达到体态年轻化，预防慢性病、抗衰、防癌等目的。

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一.简介实验室即进行试验的场所，是科技的产出地，是科学的摇篮，是科学研究的基地，科技发展的源泉，对科技发展起着非常重要的作用。进入二十世纪，各类实验室如雨后春笋，研究工作广泛开展。在科技发达的今天，对于实验室微生物的控制却是束手难测，实验室对洁净度要求比较高，必需严格控制空间微生物数量，防止杂菌污染目标菌种及器皿，且实验完毕后要对样本进行销毁、空间及器材进行消毒防止微生物对外环境污染。实验室的消毒，一直都是工作人员很头疼的问题。但是又必须做好，否则工作就没法很好的开展。即要达到灭菌消毒效果同时又不能使人员和设备受到危害。所以一般考虑用杀菌效果好的灭菌消毒剂，还要安全无毒副作用的。一般情况下，实验所用的物质都带有毒性，经常会产生各种难闻的，有腐蚀性的、有毒的或易爆的气体。这些有害气体如不及时排除室外，会造成室内空气污染，影响实验人员的健康与安全；影响仪器设备的精度和使用寿命。二. 实验室空间污染源（1）在实验室当中的大部分实验员来自不同的生活环境，可能有一部分实验员缺少很好的自我卫生习惯，因此进入房间当中，所需要标本、模型让其操作道具，每一种模型会有很多人进行接触，标本在我们不知不觉当中已经变成了无形病毒的传播能够存在的介质，再加上某些实验员的不良习惯，尤其是部分实验员有吃食物的爱好，就能够使得病从口腔进入身体的情况出现。（2） 实验室当中标本、物品很多，在实验员运用后，对于标本、模型采用置之不理得态度，能够使得标本以及道具沾染细菌。（3） 实验室的消毒产品并不能进行全面杀毒灭菌，甚至一部分的实验室没有进行消毒杀菌。（4） 实验室人员没有完全使用实验室制度来进行操作或者没有依照实验室的相关要求学生进行试验。（5） 有些试验要求使用“菌罗”以及储存“菌落”的实验室不可以完全按照要求，在实验室操作实验员决定没有必要完全按照操作进行，因此对自我造成伤害。三. 实验室空间污染分类实验室生物源危害主要是由微生物。尤其是病源微生物引起的。包括细菌。病毒。寄生虫等。在实验室内做试验、研究等操作时。实验人员需要处理大量的病源微生物，很容易引起污染。根据生物污染的对象，为空气污染、水污染、人体污染、物体表面污染等种类。1．对空气的污染：根据污染空间，可分为实验室内环境空气污染、实验室外环境空气污染。许多操作可产生气溶胶。气溶胶（aerosol），是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，又称气体分散体系。其分散相为固体或液体小质点，其大小为10﹣75px～10﹣175px，分散介质为气体。当气溶胶不能安全有效地限定在一定范围内，便导致实验室内空气污染。2．对水的污染：实验中会产生大量污水，医院污水尤其是传染病医院，综合医院传染病房的污水，有大量的有机悬浮物和固体残渣，还不同程度的含有多种细菌、病毒和寄生虫虫卵。这种污水不经处理直接排入江河、池塘或直接灌溉，可污染环境和水源。当人们接触成食用污染水时，可能使人致病或引起传染病的流行。3．对人体的感染：人是实验室污染最容易侵袭的对象。其污染途径包括接触污染物或吸入病源微生物气溶胶。原因有几下几种：（1）实验室事故引起的污染，通过器械、破碎且污染的玻璃器皿、针头刺破伤而发生。（2）实验室动物引起的感染。（3）气溶胶引起的感染，通过呼入被污染的气溶胶而感染。（4）其他：工作区与生活区相混，下班或餐前不洗手而感染。4．对物体表面的污染：实验人员的皮肤、鞋底、感染性物溢出或溅出后处理不当可造成墙壁、地面、台面、仪器和其他等物体表面的污染。四. 实验室常用消毒剂1、紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200-300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。2、熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升-汞与高锰-酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭-酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8ml/m用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m高锰-酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰-醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。3、臭氧灭菌臭氧极不稳定，分解时释放出自由基态氧，自由基态氧具有强氧化能力，可以穿透细胞壁，氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的葡萄糖氧化酶；也可以直接与细菌、病毒发生作用，破坏其细胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使细菌的物质代谢生长和繁殖过程遭到破坏；还可以渗透细胞膜组织，侵入细胞膜内作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖，促进细胞的溶解死亡，并且将死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热原（细菌病毒代谢产物、内毒素）等溶解变性灭亡。

微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。一 显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。（二） 基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lmL菌液中的总菌数。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A?B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A?B（个）（三）器材1．菌种 酿酒酵母2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。（四）操作步骤l．菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3．加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。4．显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。5．清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

问：在用qEP做支原体检测的时候，加入内控对照品，在仪器设置上是需要选择两个通道吗？答：是需要2个通道，一个FAM, 一个HEX，HEX是对应内控的通道。问：我想问一下，7500仪器里面没有HEX这个通道选项，可以用哪个通道代替呢？答：7500这款是没有HEX荧光标识，不过问过厂家，说7500有VIC，可以用VIC通道。问：qPCR结果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中这个不相关是具体指什么？答：这个不相关是指如果FAM是阳性，那么由于扩增时存在竞争性抑制，所以内控是否有扩增，其无关紧要。问：在用样品制备试剂盒时，进行支原体DNA提取时，加入内控对照品，实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA，而无法监测这步操作的回收率的，是吗？答：“实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA”，可以这么理解，或者说是在监测整个提取过程。我们又问了一下厂家，内控和样品的提取效率是一样的，这样可以反映样品的真实-情况，因为只要内控提取后能测出来，那就表明提取是没有问题的。极少量的支原体如10CFU的，通过提取，也是可以检测到的，表明灵敏度是没有问题的。样本Ct值和10CFU的Ct值比较，是可以进行相对定量的。问：你们好，我问一下你们这个Venor Gem qEP试剂盒能做放行检测吗?答：放行应相当于国外说的release testing, 这个qEP试剂盒是符合国外药典规定的性能，能做放行检测的。同时需注意要做支原体DNA抽提才行，抽提是用另外一个盒子，见厂家的venor gem sample preparation kit。问：这个如果是用来检测细胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？答：只要是跟药典有关，跟临床治疗或制药检验有关，就需要提取DNA。如果仅仅是科研用培养细胞，筛查支原体，则可以不提。问：询问qPCR仪器的设置答：具体可见MB厂家文件Venor?GeM qEP: Cyclers Programming，可从网-站上下载。问：被动参比染料是选“none”吧？答：对，没有ROX，选none问：大家好，想咨询一下，咱们支原体DNA提取时所取的样本量是依据什么定的呢，比如，我们有CAR-T细胞，病毒液等，如果CAR-T细胞按细胞数来的话取多少细胞数比较好，或者如果病毒液按体积的话多少体积更佳呢？答：支原体 DNA 提取试剂盒可从最多含有 1X 106细胞/ml 的细胞上清中直接分离 DNA，病毒没有要求。总体积最多 200μl。提取的样本就是细胞上清，ATMPs（高级医用药品），细胞培养基等。病毒液应该也是最初来自细胞上清吧。样本量是根据支原体污染量得出的经验值，跟核酸纯化柱上的DNA膜吸附能力有关。问：病毒液就是类似细胞上清的。如果体积大于200ul的话我们可以浓缩，但是这个体积有没有一个上限呢？答：体积有上限，是200 to 1000 ?l, 可以参看经典法试剂盒的那个说明书里对样本处理那一块。这个样本量同时还考虑了灵敏度，使检测达到最-佳的灵敏度。如果细胞数高于1X 106细胞/ml ，那必须要先调细胞数了。或者减少样本体积，总细胞数不超，也行。问：您好，我这边要提取10cfu对照品的基因组，10cfu对照品的说明书写着用1ml基质重悬，基因提取试剂盒说一次上样200μl进行提取，想问您一下，用200μl基质重悬10cfu可以吗，想一次提完。答：还是建议用1ml的基质重悬，因为灵敏度是以10CFU/ml为单位的。如果用200ul，浓度就高了。厂家建议10CFU标准品复溶了以后，要立即用完，不要再保存，担心可能降解。问：那1ml溶解的标准品，按提取试剂盒的要求，就得用多个管子一次提完对吧？答：是的。问：这个抽提试剂盒的收率有多少，是磁珠还是吸附柱？吸附柱的收率最-好能有，因为以前我们用其他品牌的抽提试剂盒，收率只有百分之六，这样的话，就存在假阴性结果的可能。答：是吸附柱的方法。提取试剂盒的COA里，用的是很少量的支原体10CFU/ml，提取DNA后都可以检测到。厂家来信说，产率依赖于DNA的类型（如GC含量，是基因组还是质粒）、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况，操作者很难达到生产商所给的比率，从而形成各种讨论，因此产率没写到说明书里。问：要检测支原体的培养基中有酚红，是否还需要抽提？答：只要是在25ulPCR体系中加入的样本量≤2ul，酚红就不会对qPCR构成问题。更高浓度的酚红会引起基线偏移，造成灵敏度降低。如果仅仅是筛查，则不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的产品放行检查，则需要抽提了。细胞基质的验证总是要做的。问：做qPCR，一个阴性对照Ct约为40，也有扩增曲线。是什么原因？答：Ct值大于40可能是由于产生非特异性信号（如primer artefacts）以及极微小的污染所致。 但是，该结果是不具有可重复性的，因此结果仍然是阴性。问：一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒？有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU？答：厂家回复如下：意思是一步法的样本量为2ul用于支原体筛查，经典法为10ul，用于产品的放行检测。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够，很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒，可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。它和经典法（不含酶）的交叉验证确实做过，显示同样的灵敏度。但全套的验证没有做过。问：支原体10cfu标准品是干粉吧？ 配完后是多少体积？答：是冻干粉，加基质液后是1ML体积。问：基质液产品里带吗？答：这个产品里不带，是客户自己要检测哪类样品，就用样品里的基质液（例如用的哪个培养基）问：PCR经典法，跑胶时体现1条阳性带，是否代表PCR经典法可以检测多种支原体，无法区分支原体种类。答：PCR经典法，跑胶时为1条阳性带，无法区分支原体种类，需要将扩增产物测序鉴定。

铁对体外的细胞培养非常重要(1)(12)。它作为一些酶的辅因子，参与了细胞的多种生理功能，其中至少有如下三个重要方面：01、参与细胞的呼吸代谢线粒体是细胞氧化代谢的部位和能量中枢，其中，线粒体膜上的琥珀酸脱氢酶扮演着关键角色。铁即是琥珀酸脱氢酶的一部分，参与细胞的氧化代谢和能量生成。02、保护细胞不受氧化损伤铁作为铁卟啉结构的核心，是过氧化氢酶和过氧化物酶等酶的关键组成部分，能消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类的毒性，使细胞免于遭受H2O?等过氧化物带来的损伤，为细胞提供抗氧化防御，使细胞更健康。03、提高细胞密度和存活率铁是细胞增殖所必需的元素。如果没有铁，细胞就不能在增殖时从G1期进入到S期（2,3）。缺铁会导致细胞凋亡和死亡（4）。如果缺乏铁， 细胞复制时DNA合成将受到影响。因为铁是RNA聚合酶所必需（11），它也是核糖核苷酸还原酶的组成部分（5）。而核糖核苷酸还原酶是细胞在合成DNA过程中，将核糖核苷酸转变成脱氧核糖核苷酸的限速酶（6）。已知有药厂已开发铁配方专-利，用于加入到细胞培养基中，以提高细胞密度和存活（10）。对于无血清培养基，铁也是一种重要的补充剂。有研究显示，在无血清培养基中，铁能诱导LI 210细胞生长。并且它不依赖转铁蛋白的存在（7）。在将铁强化小牛血清作为胎牛血清（FCS）的替代品方面，从1988年以来，已陆续有一些相关报道，如对于一些细胞系，铁强化小牛血清在促细胞生长或克隆率方面，等效或优于FCS(13)。对于牛肌源细胞，在DMEM/M199培养基中添加铁强化小牛血清，在细胞增殖速率方面，优于胎牛血清、新生牛血清和马血清（8）。在CHO细胞的HGPRT基因突变试验中（该实验常用于化学物的遗传毒性检测），在倍增时间和克隆率方面，补铁型小牛血清和FCS没有显着差异，补铁型小牛血清完全可以取代FCS，从而降低实验成本（9）。值得指出的是，铁强化牛血清的使用效果与细胞类型和所用基础培养基关系密切。在一项细胞长期生长的比较研究中，发现铁强化小牛血清性能不如FCS，但优于小牛血清（14）。因此，使用铁强化牛血清，可以预期，其性能必然优于普通牛血清。

胎牛血清是细胞培养中常用必备的添加培养基。它营养丰富，大约含有三四百种不同成分，具有基础培养基所不具备的营养因子。远慕生物为您分析胎牛血清给细胞提供的六个益处。它给细胞提供的益处主要有六个方面1. 提供细胞生长所需的天然激素或天然生长因子, 如胰岛素、IGFII等。2. 提供天然的结合蛋白如胎球蛋白、白蛋白等，能识别氨基酸、脂质、金属离子和激素等，能结合并调节它们的活性。胎球蛋白（Fetuin），具有多个钙离子结合位点，能调节血清中的钙离子浓度。3. 提供细胞外基质成分，便于细胞粘附、贴壁、铺展。当然，有些细胞也能分泌部分外基质成分，但血清中的更不可少。4. 提供解毒和抗氧化功能。如牛血清中有金属硫蛋白，铜蓝蛋白等。对多种重金属有高度亲和性，并可清除细胞生长环境中的氧自由基（·O），可防止细胞衰老。5. 酸碱缓冲, 维持渗透压。6. 提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。因此在细胞消化时，常用含血清的培养液终止胰酶对细胞的作用。由于胎牛血清几乎是通用的生长添加物，因此它不需要为每一类细胞优化培养基，节省了大量时间和精力。市面上有好多胎牛血清的品牌，一般进口血清质量更好一些，可从源头保证产品的质量。好的胎牛血清具有如下特点：极低内毒素（＜3EU/ml），使细胞更健康，实验更顺利。七次无菌过滤，最后三次为0.1 ?m无菌过滤处理。严格质检，符合国际动物协会要求。每个批次产量为2000-3000瓶，供应充足，确保细胞实验数据稳定。全程冷链运输。

试剂、试剂盒 封闭缓冲液 封闭液 细胞悬浮缓冲液 抗体 LB 培养基仪器、耗材Sorval GSA 转子或相当转子 适用于处理细菌的超声波破碎仪 大肠杆菌 Y1090 hsdR材料缓冲液和溶液贮存缓冲液和试剂的组分请见时录 12。将贮存液稀释到适当的浓度。封闭缓冲液10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)150 mmol/L NaCl0.05%(V/V)Tween-20封闭液（1%m/V 明胶,3%m/V 牛血清白蛋白，或 5%m/V 脱脂奶粉）这些封闭试剂的优点，不同实验室备执一词。我们建议使用者进行预试验确定哪种封闭液与所选择的第一抗体和第二抗体匹配最-优。封闭液可以贮存于 4°C，重复使用数次。加人终浓度为 0.05%(m/V）的叠氮-化钠用以抑制微生物的生长。细胞悬浮缓冲液50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)过滤除菌，以 50 ml 等分后贮存于 4°C。抗体制备用于文库筛选的抗体培养基LB 培养基离心机和转子Sorval GSA 转子或相当转子专用设备适用于处理细菌的超声波破碎仪载体和菌株大肠杆菌 Y1090 hsdR该菌株可以从 Stratagene,Life Technologies 或 ATCC(www，atcc.org) 获得。方法1. 在 LB 培养基中培养 100 ml 大肠杆菌 Y1090 hsdR 株达到饱和。2. 于 4°C 以 5000 g 离心10min 收获细菌。3. 细菌重悬于 3 ml 细菌悬浮缓冲液中。反复冻融数次，再于 0°C 用最大功率超声波处理 6 次，每次 20s。4. 提取液于 4°C 以 12000g 离心 10 min, 将上清液转移到另一试管内，所得裂解液贮存于-20°C。5. 使用裂解液前先用封闭液以 1:10 稀释用于筛选的抗体制剂。 

实验方法原理 这是一种快速简便提取植物总DNA的方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨，以机械力破碎细胞壁，然后加入十六烷三甲基-溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破裂。同时将核酸与植物多糖等杂质分开（十六烷三甲基-溴化铵，简称CTAB，是一种阳离子去污剂），再经氯-仿-异-戊醇抽提去除蛋白，即可得到适合于酶切的DNA。实验材料 幼嫩的植物材料试剂、试剂盒 液氮 CTAB抽提缓冲液 NaAC Tris-HCl  EDTA 氯-仿 异-戊醇 TE buffer仪器、耗材 瓷研钵 离心管 离心机 一、实验试剂及材料1.  材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。2.  试剂：液氮，CTAB抽提缓冲液：2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基三甲基-溴化铵)，1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Hcl pH8.0，3M NaAC，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，氯-仿：异-戊醇（24:1），异丙醇 ，70％乙醇，TE buffer。二、实验方法1.  取0.5 g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干。2.  植物材料剪成1 cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中。3.  加入液氮速冷，研磨成细粉（越细越好）。4.  在5 ml离心管中加入抽提缓冲液2.5 mll，60℃保温1小时。5.  15 000 rpm，离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。6.  加入等体积氯-仿：异-戊醇（24:1），混匀抽提至水乳胶融状。7. 15 000 rpm，离心10分钟。8.  上清转入另一个新的离心管中。9.  加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30 min-1 h，缓缓混匀DNA成絮状折出。10.  15 000 rpm，离心10分钟，弃上清。11.  DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。12.  加入400 ul TE buffer溶解DNA。注意事项：真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。其他 以下几点可能会有所帮助： 1. 坚持使用2-巯-基乙醇和PVP； 2. 取幼嫩一点的材料； 3. 低温； 4. 快速； 5. 酚氯-仿抽提离心后， 小心吸取上清液， 求质量而不求数量； 6. 压轴的一点技巧， 酚氯-仿抽提时尽可能充分混匀。

方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。划线得到单菌落，37℃培养箱培养约17小时， 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶。37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时，将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g，建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第1次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最-简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。现在大肠杆菌转化效率最-高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最-好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最-好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2 离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第1次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。方法二1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5，JM109，HB101等，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个，接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多，会影响效率。3.在18度150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温，但不可高于37度。4.OD600约0.4-0.8时停止培养，放在冰水中冷却10分钟。5. 4度，300RPM离心15分钟，回收菌体。6.去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10分钟。7.再次离心回收菌体。8.用1/12.5体积的TB悬浮，添加最终浓度为7%的DMSO，再冷却10分钟。9.0.1 -1毫升分装，直接在液氮中冻上。10.在液氮或-80度保存。【zihudie 】（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（5）重复第4步操作。（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。本法效率极高，建议大家采纳【yog】1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)2. 2ml，冰浴15min，4度，6000RPM 5min，弃上清，悬浮于1ml0.1MCaCl2 中，冰浴20min3. 4度，6000RPM 10min，重悬浮于200μl0.1MCaCl2中，冰浴30min建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。以下为转贴，具体方法请最-好查阅文献。E.coli感受态细胞制备方法:单菌落平板至2ml LB，37℃ 250 r/m，1ml 转至50 ml LB，37℃ 250 r/m至 A600=0.2-0.4离心后用10毫升TSS重悬后，分装 -70℃保存。尽量冰上操作.转化: 加质粒(TSS:7.0ml pH6.1 LB2.0ml 50% PEG60000.5ML dmso0.2ML Mg2 (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)0.3ml ddH2O

流浸膏剂或浸膏剂系指药材用适宜的溶剂提取，蒸去部分或全部溶剂，调整浓度至规定标准而制成的制剂。除另有规定外，流浸膏剂每ml相当于原药材1g，浸膏剂每1g相当于原药材2~5g。流浸膏剂除特殊规定外，一般都以不同浓度乙醇为溶剂，用渗漉法制备，有时也用浸渍法和煎煮法制备，亦可用浸膏剂加规定溶剂稀释制成。 实验材料 甘草试剂、试剂盒 氨溶液 乙醇 蒸馏水仪器、耗材 天平 烧杯 玻璃棒 量筒 漏斗 滤纸 筒实验步骤 1.  50 g甘草粗粉中加1:200氨水50 ml,湿润15分钟,装筒,排气,浸渍24小时。2.  快速渗漉（3-5ml/分钟）。3.  滤液（为药材4-8倍或至无甜味）煮沸5分钟，倾泻过滤，水浴浓缩至约35 ml。4.  冷后加浓氨-水适量至显着氨臭，含测，加乙醇与蒸馏水至50 ml，静置、滤过即得。注意事项 1.  一般药材用7号粉为原料，太细易者塞滤孔。2.  已湿润的药粉装筒时，压力要均匀，松紧要合适，装筒后要排气，再进行浸渍，以免影响渗滤完全。3.  本品含甘草酸不得少于7%，含乙醇量为20-25%。

目的要求：1．掌握甾体皂苷元（亲脂性和中性成分）的提取方法。2．熟悉薯蓣皂苷元的性质及鉴定法。简介：薯蓣皂苷元（Diosgenin）是一种甾体皂苷元，分子式（C27H42O31）,分子量414.61，为白色结晶，mp204～207℃，[ ]25D-129.3（CHCl3），溶于一般有机溶剂和醋酸，不溶于水。目前，是制造多种甾体药物如口服避孕药（I号，II号避孕药片）和甾体激素（如可的松）等的重要原料。在植物界主要分布在薯蓣科薯蓣属（Dioscorea）植物中，我国的薯蓣属植物有80余种，其中只有薯蓣根茎组（Stenophora）的17种、I亚种及一变种才含有甾体皂苷元，其它则含有多量淀粉，无皂苷元。已用于生产的主要有盾叶薯蓣（D.Zingiberensis C. H. Wright），穿龙薯蓣（D.nipponica Makino），黄山药（D.panthaica prain et Burkil）,紫黄姜(D.nipponica Makinovar rosthani prain et Burk)等。在植物体内薯蓣皂苷元是与葡萄糖、鼠李糖结合成薯蓣皂苷（Dioscin）而存在。提取分离时，一般是先用稀酸将薯蓣皂苷水解成薯蓣皂苷元与单糖（葡萄糖、鼠李糖）。因薯蓣皂苷元不溶于水，混存于植物残渣中，故可用有机溶剂（如石油醚）直接从植物残渣中提取出薯蓣皂苷元。提取方法：1．皂苷预试：2．薯蓣皂苷元的提取：注一：检查薯蓣皂苷元是否提尽，可用李伯曼反应，参考实验二“注三”项下。注二：回收石油醚的方法见实验一“注四”项下。注三：所得薯蓣皂苷元（粗品）用石油醚抽洗后，即可测定熔点，若熔点不合格时，才进行重结晶。薯蓣皂苷元的鉴定：1．熔点测定：204～209℃2．薄层层析鉴定：应只呈现一个与标准Rf值一致的色斑。样品：白色结晶的无水醇液标准品：薯蓣皂苷元无水醇液1）吸附剂：AI2O3软板（中性100～200目，活性Ⅲ级）展开剂：苯一甲醇（9：1）2）吸附剂：硅胶H-CMC硬板展开剂：石油醚-乙酸乙酯（7：3）显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液。喷雾后加热10～20分钟3）化学反应：①Liebermann-Burchard反应②CHCI3-浓H2SO4试验③五氯-化锑反应（Kahlenberg反应）：与五氯-化锑的氯-仿溶液呈紫蓝色。4）制备衍生物：乙酰化物的制法：取样品100mg溶于3ml吡啶中，加入20ml醋酐，煮沸半小时至一小时后，将反应物倒入冰水中（冬季操作使用冷水即可）。待析出白色晶体后，抽滤，析出物丙酮重结晶即得。mp196～193℃。5）紫外吸收光谱的测定：取样品5mg，加入浓H2SO4 10ml，在40℃水浴上加热1小时，放冷，测定。薯蓣皂苷元应有以下zui大吸收峰：λmax 271nm 415nm 514nm10gε 3.99 4.06 3.6

实验方法原理：皂苷别称碱皂体;皂素；皂甙；皂角苷；或皂草苷。皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，主要分布于陆地高等植物中，也少量存在于海星和海参等海洋生物中。 许多中草药如人参、远志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分都含有皂苷。有些皂苷还具有抗菌的活性或解热、镇静、抗癌等有价值的生物活性。1．检品溶液的制备：1）取皂角碎块1g于大试管（或小烧杯）中，加蒸馏水15ml，于30~90°水浴上浸渍15分钟后过滤，滤液供鉴别用。2）取薯蓣碎块0.5g加上法同样制备得薯蓣水浸液。3）取薯蓣碎块0.5g于大试管或小锥形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上温浸15分钟，滤液供鉴别。2．鉴别试验：（1）溶血试验：取滤纸片一小块，于小心处滴加皂角浸液一滴，待干后于同处再滴加一滴，如是反复操作至滴加数滴，干燥后无喷雾血球试液（取牛血、羊血或兔血一份，用玻棒或棉签搅和，除去凝集的血蛋白，加pH7.4磷酸盐缓冲液一份稀释即得），数分钟后观察在红色的背底中是否出现无红色的黄色（或透明）斑点（中心处皂解浸液原点）。（本反应亦可在试管中进行，血球试液中草药浸液中的皂苷溶解后，血球液由浑浊变为澄明。此外还可在载玻片上进行，并在显微镜下观察血球破裂溶解前后的状况）。（2）泡沫试验：薯蓣浸液，皂角浸液各2ml，分别置于试管中。用力振摇一分钟后放置，在10分钟内观察二管是否都有持久性泡沫产生？（3）醋酐浓硫酸试验（Liebermann-Burchard反应），皂角浸液5ml，于蒸发皿中在水浴上蒸干，加入1ml醋酐使其溶解，滴于干燥比色盘中，从边沿缓缓滴加浓硫酸1滴，观察颜色变化。另取薯蓣浸液5ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸干，加入1ml醋酐溶液，并倾入比色盘中，（试管）沿管壁加入几滴浓硫酸，观察界面间是否有紫红色环产生？（4）氯-仿-浓硫酸试验（Salkowski反应）：取薯蓣醇浸液2ml，在水浴上蒸干，有氯-仿1ml溶解，转入干燥小试管中，沿壁小心加浓硫酸1ml，氯-仿层显红或兰色，硫酸层有绿色荧光，示含甾体皂苷。注意事项：采用比色法测定总皂苷含量时，标准品可以选择两种或两种以上进行结果对比，取二者的平均值作为最终测定结果，使结果更具有意义。测定回收率时，也可以选择两种或两种以上标准品进行对比检测。其他：试验的操作采用比色法，并选择酶标仪处理数据，操作简便快捷，线性关系良好，并减少了用紫外分光光度计法操作时的大量时间，降低了时间对显色结果的影响，稳定性、精密度、重复性及回收率均达到标准要求。

一、酶消化法1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。二、离子螯合剂不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显着影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。三、物理法直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。四、冷冻法此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚-甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。材料和试剂1.细胞：贴壁细胞株2.试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）3.仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤1.吸除培养瓶内旧培养液。2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。3.置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。4.吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。6.计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。无菌操作注意事项1.操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2.点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5.瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。6.吸溶液的吸管等不能混用。

从上世纪90年代以来，借助病毒感染真核细胞，成为了实验中转移遗传物质的重要手段。其中，由于慢病毒能感染的细胞类型广泛（包括分裂与不分裂细胞，干细胞等），可携带不低于5 kb的外源基因，并具有稳定插入宿主基因组等优势，成为目前主流的工具病毒。在一些特定的实验中，我们需要为病毒的浓度，即滴度，进行测定。本文将为大家介绍常用的两种滴度测定方法。一、取舍的问题在正式做实验之前，不妨先问自己这个问题：到底需不需要准确地测定慢病毒的滴度？网上一搜，可以找到许多滴度测定的方案，也有不少商品化的试剂盒。这些方案各有优劣，但基本上都有这样一个规律：越准确，就越花时间。越省事的，就越不准确。但是，准确度对我们的实验来说，到底有多重要呢？这个问题的答案，其实是跟我们使用病毒的实验目的密切相关的。如果这批慢病毒是用来建立稳定过表达编码基因或者shrna等细胞系的，我觉得，根本没有必要对病毒的滴度进行细致地测定。至少我本人在这类情况下，是不测其准确滴度的。由于建立稳定细胞系，需要用抗生素筛选或者流式分选的方法，将阳性细胞挑出来，因此，即使感染效率没有达到100%，也并不要紧。如果你是包装和使用慢病毒的新手，本司机建议在收了粗病毒上清后，分别在3个10-cm贴壁培养体系（或等同的悬浮培养体系）中，加入0.5、1、2 ml的病毒进行感染。最后，这其中总有一到两个皿满足使用，也比完整地走一套准确测定流程要省事许多。等熟练之后，大致摸清楚了自己的实验技术，以及外源基因长度和病毒活性滴度之间的关系，就不用设3个感染梯度做实验了。比如像基于plko表达shrna这种很短的病毒基因组，在一个10-cm皿中我只加100-200 ?l。而如果是表达好几个kb的orf，或者整个慢病毒质粒很大，我可能会加1 ml甚至更多。二、快速测定法当滴度准确性并不重要时，我们可以选择一些快速测定方案。不过，目前网上主流的实验技术指导文章，围绕这部分的内容都已相对陈旧。这其中包括pcr法测定病毒核酸量，elisa法测定病毒外壳蛋白量。虽然相比我后面要讲的方法要快上得多，但这些实验一整套做下来，依然需要花费几个小时。我目前唯一使用的快速测定法，是用clontech的lenti-x gostix试纸。它本质上也是测定病毒p24外壳蛋白量的方法，但相比传统的elisa法来说，可要方便不少。当然，最后得到的结果，也不如elisa法来得准确。只不过这种不准确性，是可以接受的。具体的实验步骤是，在收获病毒之前，取20 ?l 293t细胞培养上清滴到试纸上，再滴加3-4滴chase buffer，后静置5-10 min，等试剂均匀在试纸上展开后显色即可。只要在t那里有条带显示，就证明慢病毒粗上清达到可用滴度。三、准确测定法目前，所有的快速测定法都是不准确的，因为它们都没有考虑慢病毒的活性。也就是说，死病毒也会一并被测出来。在一些比较严格实验中，比如用慢病毒做rnai-screening或crispr-screening，由于需要严格控制moi，就需要测定慢病毒的准确滴度。1、荧光报告基因法对于携带荧光报告基因的慢病毒来说，测定起来可要简单得多。大致的实验流程是：    在6孔板中，均匀地种入1~3×10^5个细胞。可不等细胞贴壁，直接加入0、5、10、15、20、30 ?l粗病毒。若是纯化、浓缩的病毒，则按照浓缩比例，取一点点按比例重新回去，再按上述体积加入细胞中。可加入终浓度为2-10 ?g/ml的polybrene。每孔培养基+细胞悬液+病毒+polybrene的总体积为1.5-2 ml。    细胞贴壁，换液。    第三或第四天，用流式细胞术，或者荧光显微镜（可用hoechst 33342染总细胞），计算各剂量组带荧光的细胞比例，就可以换算出原始的平均病毒滴度。如果第一天加入的病毒是稀释过的，记得将算出来的数值再乘一下稀释倍数。具体的公式就不用啰嗦了吧，小学初中的数学题而已。值得注意的是，当病毒滴度较高时，很容易在高剂量组中达到100%阳性。这样的数据是不可以参与平均滴度计算的，因为这代表着，很可能同一个细胞感染了2个甚至更多的活性病毒颗粒。事实上，当阳性细胞百分比超过50%的时候，这种多重感染的可能性就比较高了，若直接计算，就会低估实际滴度。遇到这样的数值，剔除便是。用什么细胞来测滴度，也是值得思考的一个问题。虽然网上许多方案用的是293t或者hct116细胞作为宿主，但从准确度而言，我个人是不推荐的。慢病毒对不同细胞的感染能力是有区别的，而这个区别可大可小。我甚至发现，在同一个原始细胞系中分离出来的两个单克隆，对慢病毒的敏感性还有显着的区别。如果慢病毒是要用于诸如screening等要求高准确度的实验，请使用待screening的细胞作为宿主来测定滴度，这样才能保证最终测出来的活性滴度，是针对将要使用的细胞的。2、抗生素筛选法许多慢病毒载体并没有荧光报告基因，只有抗性筛选标记，这时我们只能用抗生素筛选来测定滴度了。可能有的人会问，为何要将抗生素筛选法专门拎出来说？难道跟荧光报告基因法有很大的区别吗？从原理上来说，两种方法并没有本质上的区别：它们都是计算阳性细胞的比例，从而换算原始的病毒活性滴度。但是，若细胞培养的时间较长，阳性细胞比例的变异度就会增大。荧光报告基因法的实验流程较短，在感染48~72小时后，待荧光基因充分表达，即可测定。 然而，抗生素法则需要等抗性基因充分表达后，再加入抗生素筛选数天，待彻底杀灭阴性细胞后，才能进行细胞计数并换算滴度。无论最开始种植的细胞数量如何一致、细胞密度如何均一，人为误差和生物本身的变异度都是不可避免的。只要时间一长，微小的差异就会显现出来，最终导致每一组之间换算出来的滴度数值变异度增大。此外，高剂量的病毒会给细胞的活性带来影响，或正面，或负面，这跟细胞本身对病毒的敏感性，以及所要表达的外源基因的性质，都有密切关系。总之，在较长时间培养的前提下，用高剂量组直接除以不加病毒的对照组得到的阳性细胞比例，不具有代表性。tips：在收获粗病毒后，建议额外分装几支90~100 ?l小体积管，和其他分装的大体积病毒一并置于-80℃保存。待这些小体积病毒结冰后，取出来融化，再测定滴度。这一步可以模拟一次冻融带来的活性滴度下降，这样最后测得的滴度才是真正具有参考价值的。