支原体检测系列的常见答疑

问：在用qEP做支原体检测的时候，加入内控对照品，在仪器设置上是需要选择两个通道吗？

答：是需要2个通道，一个FAM, 一个HEX，HEX是对应内控的通道。

问：我想问一下，7500仪器里面没有HEX这个通道选项，可以用哪个通道代替呢？

答：7500这款是没有HEX荧光标识，不过问过厂家，说7500有VIC，可以用VIC通道。

问：qPCR结果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中这个不相关是具体指什么？

答：这个不相关是指如果FAM是阳性，那么由于扩增时存在竞争性抑制，所以内控是否有扩增，其无关紧要。

问：在用样品制备试剂盒时，进行支原体DNA提取时，加入内控对照品，实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA，而无法监测这步操作的回收率的，是吗？

答：“实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA”，可以这么理解，或者说是在监测整个提取过程。我们又问了一下厂家，内控和样品的提取效率是一样的，这样可以反映样品的真实-情况，因为只要内控提取后能测出来，那就表明提取是没有问题的。极少量的支原体如10CFU的，通过提取，也是可以检测到的，表明灵敏度是没有问题的。样本Ct值和10CFU的Ct值比较，是可以进行相对定量的。

问：你们好，我问一下你们这个Venor Gem qEP试剂盒能做放行检测吗?

答：放行应相当于国外说的release testing, 这个qEP试剂盒是符合国外药典规定的性能，能做放行检测的。同时需注意要做支原体DNA抽提才行，抽提是用另外一个盒子，见厂家的venor gem sample preparation kit。

问：这个如果是用来检测细胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟药典有关，跟临床治疗或制药检验有关，就需要提取DNA。如果仅仅是科研用培养细胞，筛查支原体，则可以不提。

问：询问qPCR仪器的设置

答：具体可见MB厂家文件Venor?GeM qEP: Cyclers Programming，可从网-站上下载。

问：被动参比染料是选“none”吧？

答：对，没有ROX，选none

问：大家好，想咨询一下，咱们支原体DNA提取时所取的样本量是依据什么定的呢，比如，我们有CAR-T细胞，病毒液等，如果CAR-T细胞按细胞数来的话取多少细胞数比较好，或者如果病毒液按体积的话多少体积更佳呢？

答：支原体 DNA 提取试剂盒可从最多含有 1X 106细胞/ml 的细胞上清中直接分离 DNA，病毒没有要求。总体积最多 200μl。提取的样本就是细胞上清，ATMPs（高级医用药品），细胞培养基等。病毒液应该也是最初来自细胞上清吧。样本量是根据支原体污染量得出的经验值，跟核酸纯化柱上的DNA膜吸附能力有关。

问：病毒液就是类似细胞上清的。如果体积大于200ul的话我们可以浓缩，但是这个体积有没有一个上限呢？

答：体积有上限，是200 to 1000 ?l, 可以参看经典法试剂盒的那个说明书里对样本处理那一块。这个样本量同时还考虑了灵敏度，使检测达到最-佳的灵敏度。如果细胞数高于1X 106细胞/ml ，那必须要先调细胞数了。或者减少样本体积，总细胞数不超，也行。

问：您好，我这边要提取10cfu对照品的基因组，10cfu对照品的说明书写着用1ml基质重悬，基因提取试剂盒说一次上样200μl进行提取，想问您一下，用200μl基质重悬10cfu可以吗，想一次提完。

答：还是建议用1ml的基质重悬，因为灵敏度是以10CFU/ml为单位的。如果用200ul，浓度就高了。厂家建议10CFU标准品复溶了以后，要立即用完，不要再保存，担心可能降解。

问：那1ml溶解的标准品，按提取试剂盒的要求，就得用多个管子一次提完对吧？

答：是的。

问：这个抽提试剂盒的收率有多少，是磁珠还是吸附柱？吸附柱的收率最-好能有，因为以前我们用其他品牌的抽提试剂盒，收率只有百分之六，这样的话，就存在假阴性结果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取试剂盒的COA里，用的是很少量的支原体10CFU/ml，提取DNA后都可以检测到。厂家来信说，产率依赖于DNA的类型（如GC含量，是基因组还是质粒）、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况，操作者很难达到生产商所给的比率，从而形成各种讨论，因此产率没写到说明书里。

问：要检测支原体的培养基中有酚红，是否还需要抽提？

答：只要是在25ulPCR体系中加入的样本量≤2ul，酚红就不会对qPCR构成问题。更高浓度的酚红会引起基线偏移，造成灵敏度降低。如果仅仅是筛查，则不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的产品放行检查，则需要抽提了。细胞基质的验证总是要做的。

问：做qPCR，一个阴性对照Ct约为40，也有扩增曲线。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于产生非特异性信号（如primer artefacts）以及极微小的污染所致。 但是，该结果是不具有可重复性的，因此结果仍然是阴性。

问：一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒？有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU？

答：厂家回复如下：意思是一步法的样本量为2ul用于支原体筛查，经典法为10ul，用于产品的放行检测。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够，很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒，可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。它和经典法（不含酶）的交叉验证确实做过，显示同样的灵敏度。但全套的验证没有做过。

问：支原体10cfu标准品是干粉吧？ 配完后是多少体积？

答：是冻干粉，加基质液后是1ML体积。

问：基质液产品里带吗？

答：这个产品里不带，是客户自己要检测哪类样品，就用样品里的基质液（例如用的哪个培养基）

问：PCR经典法，跑胶时体现1条阳性带，是否代表PCR经典法可以检测多种支原体，无法区分支原体种类。

答：PCR经典法，跑胶时为1条阳性带，无法区分支原体种类，需要将扩增产物测序鉴定。