1溶液配制:1.1 Buffer P1:(悬浮用)  成分：50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A  配制：  2M Tris.HCl, pH 8.0  25mL  0.5M EDTA, pH 8.0  20mL双蒸水至 1L，灭菌。使用前每1L buffer加入100mg RNAse A，并于4℃保存。1.2 Buffer P2：（裂解用）  成分：200mM NaOH, 1% SDS  配制：  8g NaOH固体溶解于500mL双蒸水中，成0.4M NaOH溶液  10g SDS溶于500mL双蒸水中，成2% SDS溶液  使用前将上述两种溶液等体积混合后使用  注意：    Buffer P2混合后不宜放置时间过场，每次配够一周使用的即可。长时间放置容易产生沉淀。若有沉淀产生，在37℃保温一段时间使沉淀溶解。1.3 Buffer P3：（中和用）  成分：3M KAc（醋酸钾），pH4.8  配制：将147g KAc 溶于350mL双蒸水中，用约60mL冰醋酸调节PH值，然后继续用浓盐酸调节pH值至约5左右.蕞后定容至500mL。1.4 Buffer QBT:(平衡用)成分：750mL NaCl; 50mM MOPS.Ph7.0;15% 异丙醇，0.15% Triton X-100配制：溶解43.83g NaCl, 10.46g MOPS到800 mL 双蒸水中，调节pH值至7.0，然后加入150mL 异丙醇和15Ml Triton X-100,加水定容至1L。1.5 Buffer QC：（洗涤用）成分：1.0 M NaCl，50Mm MOPS, Ph7.0配制：溶解58.44g NaCl, 10.46 MOPS至800 mL 双蒸水中，调节pH值至7.0,然后加入150mL异丙醇，定容至1L。2 Qiagen-tip 20质粒小量提取操作步骤2.1 取过夜培养的菌液2mL，12000rpm离心30秒至1分钟，去净上清。2.2用0.3mL Buffer P1重新充分悬浮沉淀。2.3加入0.3mL Buffer P2，轻轻颠倒摇匀，室温下放置5分钟。注意：此步不应剧烈振荡，否则容易在所提质粒中混入基因组DNA。2.4 Buffer P2使用后应盖紧盖子，否则NaOH易与空气中的CO2起反应。2.5 加入0.3mL Buffer P3，轻轻混匀，于4℃冰箱中放置10分钟。12000rpm高速离心15分钟。2.6 用1mL Buffer QBT平衡Qiagen-tip 20柱，并让QBT慢慢流下。2.7 将步骤5所得的上清倒入已平衡好的Qiagen-tip 20柱，让其慢慢流下。2.8 每次用1mL QC清洗Qiagen-tip 20柱，清洗3次。2.9用0.8mL QF洗脱DNA。2.10 用0.6倍体积（500uL）的异丙醇沉淀质粒，颠倒混匀，室温放置5分钟,12000rpm高速离心15分钟。2.11去上清，用1mL 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm高速离心3分钟，去净上清。2.12重复步骤11一次。注意：洗涤时，每次用吸水纸吸一下，尽量去净残余的液体。去净上清很重要，否则除不净多余的盐分，将严重影响的后面的测序反应。2.13 抽干多余的乙醇，用30～50uL双蒸水溶解DNA,取2uL电泳检测定量，用于测序。3 Qiagen-tip 20柱子的清洗处理3.1用5mL缓冲液清洗柱子，洗去多余的DNA及其他杂质，备用。

分类：1.根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。2.根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。3.根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。功能：质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

不论你是刚入实验室养细胞的萌新，还是有着数十年细胞培养经验的大牛，都会碰到细胞生长速度缓慢、形态变差、细胞脱壁、边缘萎缩等许多问题，明明已经为细胞“鞍前马后”、关怀备至，但各种意外还是频频发生。出现以上状况，你的细胞很可能是营养不良了。细胞在体内依附于机体生长，由血液循环提供能量和物质，在体外培养细胞则需要基础培养基营造生长环境，并由血清提供细胞生长所需的营养物质，因此血清的质量好坏直接影响细胞生长状态。所谓“一招不慎，满盘皆输”，今天小编就跟大家聊聊在细胞培养中如何选择优质的血清？要想挑选合适的血清，首先我们需要了解血清，血清是什么？血清是指血液凝固后，去除血浆中纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色澄清液体。血清是细胞培养中用量蕞大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，发挥着极为重要的功能。血清含有各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质等维持细胞生长必须的营养物质，也含有胰岛素、氢-化可的松、地塞-米松、bFGF、EGF、PDGF、转铁蛋白等可促进细胞生长的激素、生长因子及结合蛋白。此外，血清还有解毒、缓冲、抑制蛋白酶活性等作用保护细胞不受伤害。接下来小编就从血清的分类、血清的来源和制作工艺、血清的检测标准三个环节给大家讲一讲如何挑选血清。一、 胎牛or新生牛or小牛血清？傻傻分不清血清的不同成分及其含量会因供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而有所差异。按照牛是否出生及出生时间的长短，可将牛血清分为胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、成牛血清和供体牛血清。国内外对不同等级牛血清的定义有所区别，国际上主要参考欧洲药典和美国药典颁布的指南，国内则以2015版《中华人民共和国药典》（以下简称中国药典）为标准。中国药典仅对新生牛血清做出了规定（表1 国内外对不同等级牛血清的定义）。表1，国内外对不同等级牛血清的定义· 胎牛血清：胎牛在母体内与外界隔绝，通过心脏穿刺采血，血清中营养成分和细胞因子含量高、异源物质少，品质蕞-佳，是科学研究中蕞-常使用的血清，适用于绝大多数原代细胞和细胞系；· 新生牛血清：新生牛出生后控制在一定的时间内采血，成分上比较接近胎牛血清，且来源相较于胎牛血清更加充足，性价比更高，适合培养比较容易生长的肿瘤细胞系，可以满足有大规模生产血清需求的企业。中国药典和欧美药典对于新生牛出生时间的定义存在一定差异；· 小牛血清、成牛血清：随着小牛的生长发育，血清成分会发生变化，如免疫球蛋白含量增加，血清所含的促细胞生长因子、激素及其他活性物质的组份与比例也不同。该类血清异源物质增多，成分也比较复杂，所以对细胞培养的干扰因素比较多，因此小牛血清和成牛血清一般不用于细胞培养，更多用作封闭液、稀释液等；· 供体牛血清：是通过对牛群来源管控、物?隔离和检验检疫，减少外源因子的污染，且利用活体反复采血的方法来生产牛血清，主要作为医药生产用血清。选择合适的血清，既要考虑到细胞需求，也要考虑性价比。现如今，国际上对不同等级血清的划分标准和管控要求越发严格，分级使用血清已逐渐为各行各业所认可。二、源头放心+工艺安心=品质称心牛血清是一种纯天然产物，因此牛源健康状况和生长环境就尤为重要。世界动物卫生组织（OIE）对一个国家或地区动物感染疾病（如疯牛病）的可能性有一个评价指标，称为地域性疯牛病风险评估（GBR），它将每个国家或地区的疯牛病风险进行分类和监控，以避免疯牛病的传播。从官方数据来看，澳洲、部分南美洲和北美洲国家没有疯牛病（BSE）和口蹄疫（FMD）疫情，目前中华人民共和国海关总署允许进口的牛血清产地只有澳大利亚、新西兰和乌拉圭，市面上其他血源地的牛血清都是非法走-私血清。走-私血清“鱼目混珠”，缺乏检验检疫监管，生产、冷链运输无法保障，批内和批间稳定性无法控制，导致细胞培养过程状况频发，甚至损失珍贵的细胞；其次，很多走-私的牛血清来自发生过疯牛病疫情的国家，未经检疫的血清中可能携带传染病毒，对研究和生产人员的生命健康以及下游产品带来重大威胁。

细胞是生命的最小单位，细胞生物学是生命科学研究的重要领域，细胞在地球上的物质形态演化过程同时也是地球生命演化的过程，“了解了细胞，我们就能了解生命”。细胞生物学与人类活动息息相关细胞生物学是研究生命活动的一个重要前沿学科方向。这一学科分支众多，主要关注细胞形态结构、细胞生命活动功能、细胞遗传调控以及细胞与其生命活动环境当中的各种关系。人类需要把细胞研究清楚，通过研究细胞的生命活动过程、基因调控以及细胞与微环境的关系，可以了解细胞的健康活动和发育过程。而如果缺乏对相关研究的掌握，我们便会很难认识目前面临的各种疾病，如炎症、癌症等病理细胞的活动过程等，也很难针对这些疾病的发病机制进行有效的治疗。细胞生物学与人类生活息息相关，举了一些生活中常见的人体生理反应例子来解释细胞的生命活动。小孩皮肤光滑、湿润，但随着年龄增长也会有皱纹出现，这一过程就是人体细胞的变化过程，保养皮肤的过程其实就在保养我们的面部细胞。“平时给予身体充沛的营养，进行自由运动，及时调整心理情绪，就是在保养人体细胞，调整人体大脑神经细胞健康活动，助力身心健康。”细胞生命活动受内外因素共同作用真核多细胞生命体由各种各样的细胞所组成，不同种类的细胞组成不同组织器官，执行相应组织器官的功能和行为，协同完成人体生命活动。人体从受精卵细胞发育成一个完整的个体，伴随了细胞的增殖、分化、迁移等各种细胞行为。陈正军的研究领域则包括了细胞极性与细胞迁移、增殖和肿瘤发生的相关性研究。他介绍，细胞在迁移过程中需要定位到特殊的位置上，形成一种特殊的细胞极性状态，占据它所在的功能部位并执行其生命活动过程。一个细胞如何在体内发挥作用？陈正军认为这是一个十分有趣且深奥的科学问题。细胞活动受到细胞自身遗传物质、蛋白质分子的调控，同时细胞内部的这些分子和功能单位，也会受到细胞外环境因素的影响。两者共同相互作用，使得单个细胞可以产生不同的生命活动。具体来讲，细胞生长需要改变自身的结构状态，这一过程伴随胞内各种信号物质、蛋白质、信号通路等发生变化。其中，细胞通路的变化则受部分外界因素的影响，例如化学因素、物理因素甚至生物因素。而在体内环境中，生长因子作为一种外环境因素，对细胞行为如细胞生长、迁移等的影响极为重要。细胞生长因子可实现不同细胞的功能需求细胞生长因子是促进细胞生命活动一类细胞因子广泛的概念，比如说，表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和内皮细胞生长因子等，都称为细胞生长因子。不同细胞生长因子就会帮助不同细胞维系其不同生命活动功能，如细胞增殖、迁移和分化等。不同细胞种类对细胞生长因子的需求也不同，不同的细胞生长因子也能协同调控一种细胞活动过程，比如说表皮细胞生长因子和血小板衍生生长因子对上皮细胞的增殖促进作用，多种不同细胞生长让细胞来执行不同的生命活动。每个细胞在特定的环境下都可以分泌产生细胞生长因子，通过细胞之间互相刺激或者刺激自身发挥作用。以口腔黏膜或者肠道的上皮细胞自我修复为例，当上皮细胞产生损伤，需要修复即重新执行自身的增殖功能时，上皮细胞会启动常规活动以外的一种机制，分泌生长因子帮助自己，甚至帮助周围细胞进行修复，完成功能需求。细胞生长因子通常呈多肽分子配体，可以直接与表皮生长因子受体结合，结合之后受体会把信号转到胞内，细胞内接着启动一系列蛋白质的相互作用和偶联酶促化学反应，这一过程为细胞的信号转导通路激活，通过瀑布效应放大生物信号，启动和激活细胞增殖、迁移、分化等生命活动。因此，细胞生长因子在细胞生命活动过程中起着非常重要的作用。

细胞的生长，主要是指细胞体积的增大，细胞分化完成后并不是所有的细胞都有生长的过程，大多数的组织器官都是通过不断的细胞分裂以增加细胞数量的方式来实现器官生长，只有很少数细胞（像神经元细胞）是通过增大细胞体积的方式来实现器官生长的，随着个体的不断发育，神经元细胞，特别是轴突的部分也要不断的伸长。培养过程培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期一、潜伏期(latent phase)：细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。二、指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3%－5%。指数增生期的细胞是细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。三、停滞期(Stagnate phase)细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。影响因素细胞生长受温度、渗透压等外界因素的影响。温度一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在40℃数小时后，再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。细胞在39～40℃培养1小时，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41～42℃中培养1小时，细胞损伤严重，温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。渗透压细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影响细胞基本合成系统。理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L，鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。气体环境和pH体外培养细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态，若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。采用开放式培养时(碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养)，一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长；一般不能低于1%，否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH7.2~ pH 7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至退变或死亡。各种细胞对pH的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差，永生性细胞系和恶性细胞对pH的变动耐力强。但总的来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，使培养基变酸，pH发生变化。所以，为了维持培养环境恒定的pH，多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2，但CO2易于逸出，故只适用于封闭式培养。若开放式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜。为克服NaHCO3调整的麻烦，也可用羟乙基哌-嗪乙硫-磺-酸，它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。无毒和无菌无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件。细胞在活体内，偶尔有细菌或有害物质入侵，因体内有强大的解毒系统和免疫系统，可将其解毒或清除，而不易受损害。但在离体的环境中，失去了防御系统，一旦有害物质入侵或细菌污染，可导致细胞死亡，前功尽弃。如培养瓶皿、支持物、培养基、瓶盖、瓶塞上若有细胞毒性，在培养过程中可导致细胞死亡。因此，在选用这些器皿、材料时要注意，若这些物品消毒不彻底，带菌或操作过程不小心使细胞污染，也会导致细胞死亡。若出现交叉污染，可使实验室原来的细胞系失去原有特性，应引起足够的重视(后面有详述)。

虽然微生物会使食物发霉和变质，还可能引发一些疾病，但是你知道吗？微生物在一些领域也发挥着巨大作用。首先我们需要了解一下微生物的发酵。在适宜的条件下，利用微生物将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程就是微生物的发酵。微生物的种类不同，产生代谢产物的能力不同，所以，利用不同的微生物就可以生产出人们所需要的多种产物。如今，微生物发酵技术在食品加工行业发挥着巨大作用。食品在发酵过程中会形成一个微生物循环系统，在微生物的繁殖转化下，食品的结构被改变，进而得到发酵食品。茶类食品在茶类食品的发酵过程中，合理运用微生物发酵技术，可以提升茶的品质。以普洱茶为例，普洱茶在发酵过程中酵母菌具有促进作用，可以提高发酵效率与可靠性。在酵母菌发酵过程中会产生很多活性物质，进而对普洱茶的品质产生影响。酒类食品在酒类食品的发酵过程中，制曲工艺非常关键，直接影响到酒类产品的发酵质量。制曲过程中的微生物主要有霉曲、细菌、酵母菌等，各种微生物的繁殖、代谢会影响酒类食品的加工风味和营养结构。醋类食品醋类食品发酵过程中，酵母菌会在微生物作用下自然降解，为其他微生物的繁殖提供营养物质，提升食醋的口感和品质。豆类食品豆类食品微生物发酵过程中，微生物可对豆类的纤维物质进行转化，使其成为可溶解性物质，有效发挥微生物的发酵功能。微生物发酵技术可以改善一些植物或者动物食品的特殊味道。例如乳酸菌、酵母菌在第二次发酵后可以去除甘草的腥味，使甘草提取液口感酸爽，具有酒香。除此之外，微生物的发酵还能不同程度地影响食品中多糖、蛋白质、脂肪等营养成分的含量、组成以及存在形式，同时，对于氨基酸、总黄酮、脂类等，一定的生物转化可以提高其营养价值，使其化学组成更均衡。随着消费者对食品功能需求不断地提高，微生物发酵技术也在不断地发展。有针对性的管控食品品质，也将持续作为微生物发酵的研究方向。

微生物包括细菌、霉菌、真菌和藻类等，虽然大部分微生物都对人体无害，但是由细菌病毒引发的传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第1位。微生物对人类蕞重要的影响之一是导致传染病的流行，所以微生物的检测十分重要。常用的几种微生物检测方法：1、琼脂平板培养法因培养基不同，琼脂平板法分为选择性培养基检测法和显色培养基检测法。选择性培养基是在培养基中加入选择性抑制剂来抑制非目标微生物生长;显色培养基是在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，以菌落颜色区分目的菌落与非目的菌落。2、显微镜镜检法将待测样品中的微生物富集后，于油镜下直接计数。显微镜镜检法通常与琼脂平板培养法结合使用，通过琼脂平板培养法对菌落进行定性分析，再用显微镜进行定量计数。传统检测方法虽然对设备要求不高，技术含量也偏低，但耗时长，人工消耗量大，一般检测实验室可根据实际情况合理挑选检测方法，无需拘泥于方法选择的形式。3、微生物测试片检测技术一般情况下，微生物测试片由印有网格的聚丙烯薄膜和覆盖有培养基和显色物质的聚乙-烯薄膜组成。待测样品经过处理后可直接接种在微生物测试片上，然后放置在适宜的温度下培养——使固定在测试片上的显色物质与待检微生物生长产生的特异性酶发生显色反应，形成有颜色的菌落，通过对这些菌落进行计数便可实现检测。测试片法菌落典型，易于判读，且因其操作简便、计数直观，多数可缩短培养周期从而快速得到结果，而且人为操作环节较少，商品化程度高，避免了因人为因素造成误差较大的缺点。测试片法是蕞为成熟的食源性微生物快速检测方法之一。对于一些热敏感的细菌，由于测试片在整个操作过程中均处于常温环境，可有效避免热损伤，因此能够提供更加精-准的计数结果。测试片可分别检测菌落总数、大肠菌群及大肠杆菌计数、霉菌和酵母计数、肠杆菌科计数、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等，且微生物测试片与传统检测方法之间的相关性非常好，均可达统计学上无显着性差异。目前，因其快速简便的特性，故已广泛应用于我国食品行业和环境、过程及成品的检测。

培养基灭菌是否彻底，影响因素很多，除了培养基内杂菌的种类和数量，灭菌温度的高低，时间长短外，还取决于：1. 营养成分的保持湿热灭菌时，微生物被杀死的同时，培养基的营养成分也遭到了一定的破坏，特别是氨基酸和维生素。如在121℃，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。在热的作用下某些营养成分还可能因受热而相互之间发生反应，造成培养基中原有营养成分的数量变化，因而影响培养基质量。2. 微生物的耐热性细菌芽孢的热阻较大，灭菌所需要的时间取决于把细菌芽孢减少到所规定数目的时间。3. pH值pH值对微生物的耐热性影响很大。pH值介于6.0~8.0时，微生物最不易死亡。pH4. 培养基成分油脂、糖类及蛋白质等组成的高浓度有机物会包于细胞的周围形式一层薄膜、影响热的传导。而高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，灭菌较易。例如：大肠杆菌在水中加热至60-65℃便死亡，在10%糖液中需70℃加热4-6分钟才死亡，在30%糖液中需30分钟才死亡。一般糖类含量较多的时候最好选用115℃，30分钟；一般的培养基可选择121℃，20分钟。5. 泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中的杂菌。6. 颗粒颗粒小，容易灭菌，颗粒大，则难灭菌。对于含有少量较大颗粒及粗纤维的培养基，可用粗滤的方法（不应影响培养基质量）予以除去，培养基结块会造成培养基灭菌的不彻底。7. 灭菌锅内空气是否排净这个是影响灭菌是温度和压力比例关系的要点，同样达到了相同的压力的情况下，如果空气未能排净，也就是说不是纯蒸汽灭菌，此时的温度不一定能达到目的要求，会严重影响灭菌效果。

由于标准品是自己分离获得，所以需要测定其纯度。用DAD检测器测其纯度，可能不准，有人建议用LC-MS测定，那么标准品的纯度如何测定呢?下面小编来给大家介绍。标准品的纯度如何测定呢：1、配同等浓度的溶液，用已知含量的标准品标定自己纯化标准品的纯度。标准品经MS离子化后，检测的主要色谱峰即为目标化合物的色谱峰，水分、重金属、其他结构的杂质即使保留时间一样也不会出峰干扰，结果比较可靠。2、LC-MS进样后检测总离子流，有机杂质可以产生色谱峰，该色谱峰在保留时间上与目标化合物色谱峰的保留时间会有差别，从而可以观察标准品的纯度问题。一些在DAD上不响应的杂质，在MS上会出峰，从而使测定的结果更准确。但也存在一个问题，不同化合物离子化效率不同，同样的浓度会产生不同的峰面积。3、LC-MS可以测定标准品的纯度，但必须有对照品进行比较，用已知含量的标准品外标法确定自己标准品的量值，然后换算成纯度，属于外标法定量的一种，主要能避免DAD测定纯度过程中杂质带来的干扰。其实使用LC/MS技术也不能保证准确测定纯度，LC/MS测定由于会受所采用离子化技术的限制。样品中某些杂质可能在所使用离子化技术下不能离子化或者离子化效率很低，导致该杂质不能检测到，测定纯度无法实现，当然如果所测杂质和主成分相关，一般可采用与主成分相同的离子化方法，结合适合的色谱分离方法测定。以上内容就是对标准品的纯度如何测定的介绍了，标准品就是实物标准，它是标准的另一种存在形式，它与文字标准合在一起构成完整的标准形态。标准品英文含义为参照物，实际上就是这种物质提供一个或多个量值作为其他测量值是否准确的"参照值。

霉菌生长条件分析。芽孢在室内外空气中总是存在的，其含量的多少与季节及室外空气状况相关。此外，霉菌的生长扩散，需要良好的周边环境，包括：能够附着的建筑表面，氧气，合适的温度，营养物质，湿气或自由水。此外，pH值，日光，表面粗糙度，生物体的相互作用，暴露时间等都能影响霉菌的生长 。①合适的温度条件。霉菌可以在0℃～40℃的温度范同内生长，而22℃～35℃被认为是霉菌生长的蕞佳温度 。不同种类的霉菌其蕞适温度是不一样的，大多数霉菌繁殖蕞适宜的温度为25～30℃，在0℃以下或30℃以上，不能产毒或产毒力减弱。如黄曲霉的蕞低繁殖温度范围是6-8℃，蕞高繁殖温度是44～46℃，蕞适生长温度37℃左右。但产毒温度则不一样，略低于生长蕞适温度，如黄曲霉的蕞适产毒温度为28-32℃。②必须有水分存在。Grifint在1981指出，霉菌主要吸收溶解在液体中营养物。因此，建筑围护材料中的由于结露所提供的液态水分比其周围空气中的所含的水蒸气，对霉菌的生长更起作用 。墙体中的水分一般由于建筑建造过程中带入，建成后，又因雨水和地下水渗入墙内。此外，空气中的水蒸气通过材料扩散或空气渗透进入墙体。当某一处温度低于露点温度时，湿气从蒸汽态冷凝成液态并积聚下来。国际能源署(IEA)推荐以材料中的相对湿度80%，作为预防霉菌生长的临界湿含量，后来ASHRAE引用了该标准。③要有足够的营养供给。每种建筑材料中都含有不同程度上的营养物质。Sedlbauer(2001)根据不同建材能提供霉菌生长的营养物水平，将建材分为四个等级。即使是那些不能直接提供营养物的建材(如金属、塑料制品等)，由于其积累的灰尘可能含有各种微生物代谢物，动植物的残骸，以及一些脂肪性毛屑，而为霉菌生长提供营养物。现已有很多关于霉菌对无机类建筑材料侵蚀的报告。④暴露时间问题。弄清楚霉菌生长所需的时间是个非常复杂的事情：生长需时取决于温度、周边相对湿度、材料的含湿量、日夜交替、空气流动、环境波动、材质、材质表面特性及其周围的杂质。 当环境温度在5℃～5O℃，相对湿度总是在80%以上，数周或数月通常就能引发霉菌生长。⑤必要的空气细菌所需要的气体主要是氧气，有的细菌还需要C02.根据对氧的需要程度，可将细菌分为：需氧菌：必须在有氧（空气）情况下才能生长。微需氧菌：在5%左右的低氧压环境中才能生长。厌氧菌：无氧的环境中能生长。兼性厌氧菌：在有氧和无氧环境中均能生长。

在平时之中我们会吃许多的食材，这种食材之中不仅是我们在家里之中自己制作出去的食材，也有许多食材是选购来的，针对选购来的食材，大伙儿较为担忧的就品质问题。实际上这种食材全是需要开展微生物检验达标以后才会出现在销售市场的，食品微生物检验主要是对病菌总数和有益菌等的检验。1.试品前解决相对性于传统式人工服务实际操作方式及多次重复使用的匀质乳钵器和拌和刀片，现阶段销售市场上出现类目丰富多彩的一次性匀质袋、与试品防护的敲打式匀质系统及自动化技术净重梯度方向稀释液仪，不但完成了试品前解决的自动化技术、规范化及大批量化，并且免去了试品间的交叉式环境污染。2.增菌塑造及分离出来无论传统式方式或当代无损检测技术，受检验灵巧度的限定，食品样版经前解决后多需历经增菌塑造、可选择性分离出来后才可用以事后检测分析。传统式微生物检验中所述2个流程用时长达24-96h，为全部检验步骤中的重要速度限制流程。因而，创建高效率增菌对策及其靶点高宽比特异性微生物菌种萃取、分离出来系统已变成完成微生物菌种快速检测的关键。3.试品解决试品解决应在无菌车间内开展，若是冷藏试品务必事前在原器皿中解除冻结，解除冻结温度为2～5℃不超过18h或45℃不超过15min。4.检测每个指标值都是有一种或几类检测方式，可依据不一样的食品、不一样目地来挑选适当的检测方式。一般常用的基本检测方式为现行标准国家行业标准，或国家标准，(如FAO标准、WHO标准等)，或食品进口方的标准(如英国FDA标准、日本厚生省标准、欧盟标准等)。食品环境卫生微生物检测室收到检测审批单，应该马上备案，填好实验编号，并按检测规定马上将试品放到电冰箱或冰盒中，积极主动提前准备标准开展检测。一般呈阳性试品传出后3d(特殊情况可适度增加)方能解决试品;进口食品的呈阳性试品，需储存6月方能解决。呈阴性试品可妥善处理。5.结果汇报试品检测结束后，检测工作人员应立即填好检查报告，签字后送负责人人核查签名，盖上企业图章，以表起效，并马上交到食品卫生监督所工作人员解决。

植物组织培养常见问题解析1. 培养基的配制注意事项植物组织培养蕞常用到 MS 培养基，包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，准备 MS 培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分，切记「一锅煮」，即不能将各种化合物一齐添加进去。可选用 Coolaber 的 MS 培养基基盐（PM1011）在自行加入蔗糖和琼脂配制 MS 培养基，既经济，更高效。2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH 值低于 5 很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于 MS 培养基，1 / 2MS 培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为是琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。选择 Coolaber 改良 MS 培养基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和琼脂/植物凝胶，可以省去调 pH 步骤。3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用过程中有无区别？水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，酶解更有利于发挥其作用。4. 怎么溶解组培常用植物激素？IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液；如有结晶析出，可考虑用 1 / 10 体积的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于碱性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的浓度。5. 细胞分裂素使用浓度？一般情况下在培养基中加入 0.1～10.0 mg/L 的细胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多数用 1.0～2.0 mg/L，KT 浓度为 0.5～2 mg/L，这个也要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。6. 哪些植物激素能高压灭菌，哪些不能高压灭菌。IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高温高压灭菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌，否则会分解失效，该类植物激素配制母液后需用 0.22 微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却（50 - 60℃）后尚未凝胶前加入混匀。7. 培养基的 pH 值会凝胶硬度有无影响。有影响。若将培养基 pH 值调的过高（大于 6），则培养基偏硬，增加接种的阻力，会对外植体造成损伤。若将培养基 pH 值调的过低（小于 4.5），则培养基不能凝固，起不到固定外植体的作用。一般将培养基的 pH 调节至 5.5～6.0 为宜。8. 灭菌过程会否影响培养基的 pH 值？培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化，培养基 pH 值灭菌后会有所下降，灭菌前培养基的 pH 值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。9. 应用 75% 的酒精进行种子消毒的过程中需要注意的问题种子在消毒过程中使用 75% 的酒精使用应慎重，酒精渗透力极强，消毒时间过长会直接影响种子发芽率，所以建议消毒时间不应超过 1 min。10. 原始繁殖材料的消毒组培中，作为原始繁殖材料的外植体消毒，直接影响整个培养过程的进行。从室外采回来的外植体需进行消毒，首先用自来水冲洗外植体，冲洗时间可根据采集部位不同而定，一般在 5～15 分钟即可；关键在于在超净台中进行药剂的处理，常用的药剂处理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯-酸钠溶液、和 0.1～0.2% 的升-汞溶液，具体可根据实验材料而定。应注意的是经升-汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗 6～8 次。11. 怎么处理植物组织培养过程中出现的各种污染？植物组织培养过程中的污染来源主要分为 3 种，真菌、细菌和组织培养过程中的污染源。在操作过程中，难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。另外，不正确操作也会增加污染机率。预防措施：通风，保持室内空气干燥，紫外杀菌等。污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

在进行植物激素检测之前，首先要进行植物的采集与保存，对于整个检测而言，前期的这部分工作显得意义重大。1.植物样品的收集植物安排样品多用于确诊剖析，收集植物安排样品首先要选定植株。样株有必要有充沛的代表性，一般也象收集土样一样按照一定路线多点收集，组成平均样品。组成每一平均样品的样株数目视作物品种、种植密度、株型巨细、株龄或生育期以及要求的准确度而定。从大田或试验区选择样株要注意群体密度，植株长相、植株长势、生育期的共同，过大或过小，遭受病虫害或机械损伤以及由于边际效应长势过强的植株都不该选用。假如为了某一特定目的，例如缺素确诊而采样时，则应注意植株的典型性，并要同时在邻近地块另行选取有比照含义的正常典型植株，使剖析的结果能在相互比较的情况下，阐明问题。植株选定后还要决议取样的部位和安排器官，重要的原则是所选部位的安排器官要具有最大的指示含义，也就是说，植株在该生育期对该营养的丰欠最敏感的安排器官。大田作物在生殖生长开端时期常采纳主茎或主枝顶部新老练的健壮叶或功能叶；稚嫩安排的营养组成改动很快，一般不宜采样。苗期确诊则多收集整个地上部分。大田作物开端结实后，营养体中的营养转化很快，不宜再做叶剖析，故一般谷类作物在授粉后即不再采确诊用的样品。假如为了研究上肥等措施对产品品质的影响，则当然要在老练期采纳茎秆、籽粒、果实、块茎、块根等样品，果树和林木多年生植物的营养确诊一般选用“叶剖析”或不带叶柄的“叶片剖析”，单个果树如葡萄、棉花则常做“叶柄剖析”。植物体内各种物质，特别是活动性成分如硝态氮、氨基态氮，还原糖等都处于不断的代谢改动之中，不仅在不同生育期的含量有很大的不同，并且在一日之间也有显着的周期性改动。因而在分期采样时，取样时刻应规定共同，一般以上午8—10时为宜，由于这时植物的生理活动已趋活泼，地下部分的根系吸收速率与地上部正趋于上升的光合作用强度挨近动态平衡。此刻植物安排中的养料贮量最能反映根系养料吸收与植物同化需要的相对联系，因而最具有营养确诊的含义。确诊作物氮、磷、钾、钙、镁的营养成分状况的采样还应考虑各元素在植物营养中的特殊性。采得的植株样品如需要分不同器官(例如叶片，叶鞘或叶柄、茎、果实等部分)测定，须当即将其剪开，以免营养工作。2.植株安排样品的制备与保存采得的样品一般说是需要洗刷的，否则或许引起泥土、上肥喷药等显着的污染，这对微量营养元素如铁、锰等的剖析尤为重要。洗刷办法一般可用湿布仔细擦净表面沾污物。测定易起改动的成分(例如硝态氮、氨基态氮、氰、无机磷、水溶性糖、维生素等)须用新鲜样品，鲜样品如需短期保存，有必要在冰箱中冷藏，以抑制其改动。剖析时将洗净的鲜样剪碎混匀后当即称样，放入瓷研钵中与恰当溶剂(或再加石英砂)共研磨，进行浸提测定。测定不易改动的成分则常用枯燥样品。洗净的鲜样有必要赶快枯燥，以削减化学和生物的改动。假如延迟过久，细胞的呼吸和霉菌的分化都会耗费安排的干物质而致改动各成分的百分含量、蛋白质也会裂解成较简略的含氮化合物。杀酶要有满足的高温，但烘干的温度不能太高，以避免安排外部结成干壳而阻碍内部水分的蒸发，并且高温还或许引起安排的热分化或焦化。因而，剖析用的植物鲜样要分两步枯燥，一般先将鲜样在80—90烘箱(最好用鼓风烘箱)中烘15—30分钟，(松软安排烘15分钟，致密坚实的安排烘30分钟)，然后，降温至60—70，逐尽水分。时刻须视鲜样水分含量而定，大约12—24小时。枯燥的样品可用研钵或带刀片的(用于茎叶样品)或带齿状的(用于种子样品)磨样机破坏，并全部过筛。剖析样品的细度须视称样的巨细而定，一般可用圆孔直径为1mm的筛；如称样仅1—2g者，宜用0.5mm的筛；称样小于1g者，须用0.25或0.1mm筛。磨样和过筛都有必要考虑到样品沾污的或许性。样品过筛后须充沛混匀，保存于磨口广口瓶中，内外各贴放一样品标签。样品在破坏和储存过程中又将吸收一些空气中的水分，所以在精细剖析工作中，称样前还须将粉状样品在65(12—24小时)或90(2小时)再次烘干，一般惯例剖析则不必。枯燥的磨细样品有必要保存在密封的玻璃瓶中，称样时应充沛混匀后多点勺取。3.植物微量元素剖析样品制备与保存。样品的收集与制备chapman(chapman,H.D1966 Dignostic Criteria for plants and soils,Univ.of Calif.Berkeley)的采样技术得到遍及承认，可供参考。植物微量元素剖析样品的枯燥和破坏过程中，所用办法与剖析常量元素样品类似，特别指出的是避免枯燥和破坏过程中仪器对样品的污染。例如枯燥箱中烘干时，避免金属粉末等的污染，破坏样品选用的研磨设备，应选用不锈钢工具钢刀和网筛，如要准确剖析铁，有必要在玛瑙研钵上研磨，研磨剖析标本的细度相当重要，至少经过20目筛，并充沛混合，磨细过的样品，要储存在密封的容器中，在剖析前，样品应在60—70下烘干20小时，然后再进行剖析。

1、无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成。大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括dian、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA（螯合剂）的混合。2、碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。3、维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果蕞佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。4、有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。蕞常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是蕞常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。5、生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)、植物生长素类。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯-苯氧乙酸（2，4-D）。(2)、细胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）。(3)、赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。

酪安酸差色光谱法：1.  打开分光光度剂，预热30分钟，是紫外灯处于稳定发光状态2.  在2容积为1mlde 微量石英比色杯中分别加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸缓冲液，把盛有PH12.0缓冲液的比色杯放入样品杯中放入支架上，把盛有PH7.4缓冲液的比色杯放入到参比杯的支架上，然后准确的测出295nm波长下的光吸收值，或用250－350nm扫描3.  在上述的2个比色杯中分别加入100UL的待测样品液，小心振荡混匀4.  重复2操作5.  计算蛋白浓度：﹝(PH为12.0A295-PH为7.4A295)/2.330×N﹞×WN是蛋白分子中酪安酸毫摩尔消光系数之差W是样品稀释倍数紫外光吸收法测定蛋白浓度：1．用品和仪器：紫外分光光度剂，微量自动取液仪2．试剂：标准蛋白质溶液：准确称重的纯净蛋白质，配成1mg/ml储液置于4度中备用0.1mol/l磷酸缓冲液，PH7.4;0.1mol/l磷酸缓冲液，PH12.03.试验程序：1，在2个洁净干净的石英比色杯中（内径1cm）中加入蒸馏水或其他用于溶解标准蛋白质与待测样品的缓冲液，其中一个作为参比杯（在以后测量不变），另一个作为样品杯，放入分光光度剂的相应位置2，记录下空白杯在280260nm处的光吸收值，或对之进行250－350nm波长范围的基线扫描3，移去样品比色杯中的蒸馏水或是缓冲液，干燥比色杯（用滤纸吸取残液）4，在样品比色杯中加入待测样品液，在实验中提取样品30ul加入2970ul双证水，混匀，样品液事先通过离心或用0.2um孔径的滤膜过滤5，重复2步骤6．蛋白含量计算：蛋白浓度（mg/ml）=1。55A280—0.76A260Folin法测定蛋白含量：1.用品和仪器：分光光度剂，试管及试管架，微量自动取液仪（20，100，200，1000UL）2.试剂：试剂甲：贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D（2g/100ml 酒石酸钾钠）临用前将A和B等体积混合为碳酸钠－氢氧-化钠溶液，C与D混合盛Folin-酚试剂甲，一天内有效试剂乙：取乌酸钠100G，目酸钠25G，置于2000ml膜口回流装置内，加蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10小时（烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅）再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液-溴数滴，在通风厨开口煮沸15分钟，以除去多余的溴，冷却后定容与1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，颜色为鲜黄色，置于棕色瓶中，可在冰箱长期保存，颜色变绿，在加几滴溴，煮沸数分钟，恢复原色试剂乙在使用前应该确定其酸度，使之滴定标准氢氧-化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红－紫红－紫灰－墨绿即可为终点，酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可标准蛋白质溶液：精-确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中，定容于10ML,浓度为0.3mg/ml3.实验方法：1.取16mm*150mm试管13支，标明号码，放置与试管架，在1－11号试管中分别加入标准牛蛋白血清（0.3mg/ml）0,0.1,0.2--------1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml，在12，13管中加入待测样品100UL，并补足双蒸水至1.0ml3.  加入5.0ml新配置的试剂甲，立即混匀，在室温下放置10分钟4.  各管中加入0.5ml试剂乙，充分混匀，（用振荡器），然后室温放置30－60min5.  将标准样及待测样品在可见光光度计上比色，如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色，如果在100ug/ml之内，则在550nm波长下比色6.  根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线，然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋白是溶液态），请务必在 4℃，12000rpm，离心 3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果抗体和重组蛋白体积小于 50?l，请延长离心时间至 5 分钟，以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。抗体和重组蛋白使用特制的储存管，只有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体和重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心也会离心不完全，导致出现抗体和重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用抗体和重组蛋白。2. 抗体和重组蛋白的长期保存对于 大部分抗体和重组蛋白，比较合适的保存方式是：抗体分装后保存在 -20℃，重组蛋白分装后保存在 -80℃。（1）分装可以最-大程度的降低反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体和重组蛋白造成的污染可能性。（2）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10 ?l 每份。因为分装体积越小，抗体和重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。（3）复融后的分装抗体和重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在 4℃，避免再冻起来。（4）抗体和重组蛋白工作液应该当天配制当天用完，4℃ 保存尽量不要超过 1 天。（5）绝-对避免将抗体和重组蛋白保存在自动除霜冰箱中，将抗体和重组蛋白保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。3. 抗体和重组蛋白的短期保存大部分 的抗体和重组蛋白收到后 4℃ 短暂保存 1~2 周，对抗体和重组蛋白活性没有影响。如果抗体和重组蛋白很快会使用（1~2 周内），推荐在 4℃ 保存，这是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体和重组蛋白。4. 抗体和重组蛋白的运输条件一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。4℃ 运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体和重组蛋白是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一般避免干冰运输。5. 抗体和重组蛋白的稳定性（1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果，抗体是免疫系统中最重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果，在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。（2）抗体的高Tm值，在室温下，甚至短时间温度达到 50~60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持其应有的活性。（3）抗体和重组蛋白的纯度。 采用先进的抗体和重组蛋白纯化技术，确保抗体和重组蛋白产品的高纯度，保障其抗体和重组蛋白产品的稳定性。（4）抗体和重组蛋白的浓度。高浓度的抗体和重组蛋白产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体和重组蛋白稳定性更好。 大部分抗体和重组蛋白浓度为 1mg/ml，抗体和重组蛋白纯度高，特异性好，效价更高。 6. 重组蛋白的特性重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。（1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100?g，用 86?l 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。

避免蛋白降解总体规则：蛋白酶普遍存在，在提取蛋白质的步骤中，早些抑制，经常抑制分装蛋白溶液，储存于不同的温度和不同的缓冲液中，测蛋白活性，找出最适储存条件。冷藏，并加入稳定剂。这些稳定剂一般都能充分保持蛋白的生物学活性。将蛋白溶液储于50%（V/V)的甘油或悬于硫酸铵（3.2M）中，避免冻存冰结晶会造成物理剪切及蛋白变性。避免酶的反复冻融，如果酶需要冻存，分装成小管后冻存。蛋白质的储存蛋白样品在液氮中速冻，拿出后加入10-20%的甘油，长期储存整个实验过程中，都要将蛋白样品置于冰上从母管中吸取不同的蛋白时，都要用新鲜的枪头不要将未用的溶液倒回母管戴手套操作，避免蛋白交叉污染，或是蛋白酶的污染避免剧烈的震荡，避免溶液中混入蛋白变性剂实验的过程中应避免灰尘进入，灰尘包含60%的肌氨酸操作过程中操作时总是小体积小量的操作，避免污染，并且动作要快a：此类蛋白酶在活性中心包含丝氨酸和组氨酸。b：此类蛋白酶在活性中心包含半胱氨酸（巯基，-SH-）。c：此类蛋白酶在活性中心包含金属离子（如：n2+，Ca2+，Mn2+）。d：此类蛋白酶在活性中心包含天冬氨酸族。

一、目的要求了解某一抗生素的抗菌范围；学习抗菌谱试验的基本方法。二、基本原理许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊的代谢产物，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用，例如抗生素。不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用，例如青霉素一般只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，这类抗生素称为窄谱抗生素；而另一些抗生素则对多种细菌有作用，例如四环素、土霉素对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，这类抗生素称为广谱抗生素。如果将产生某种抗生素的菌划直线接种在豆芽汁葡萄糖琼脂培养基平板上，经培养后，就会长出一条菌带，并产生某种抗生素向菌带周围扩散。再与这条菌带相垂直划直线接种某些不同的试验菌，就会产生不同长度的抑菌带，如图Ⅸ-3。根据抑菌带的长短，即可判断该抗生素对不同微生物的影响。本实验说明产黄青霉产生的青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果。三、器材产黄青霉（Peenicillium chrysogenum）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；豆芽汁葡萄糖琼脂培养基，无菌平皿，接种环等。四、操作步骤1．将豆芽汁葡萄糖琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右倒平板，凝固待用。2．用接种环挑取产黄青霉的孢子在平板上按图Ⅸ-3，1所示划一直线。3．接种后，倒置于28℃温室中培养2—3天。4．待上述平板形成菌苔后，再用接种环从产黄青霉菌的菌带边缘但不要接触菌苔分别垂直向外划直线（图Ⅸ-3，2）接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。5．倒置于37℃温室培养24小时。6．观察结果。五、实验报告1．结果绘图表示并说明产黄青霉所产生的青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效能。

EM原液的基本用法1、直接稀释法根据使用目的，将EM原液按一定比例用水直接稀释，用于作物叶面喷施、农田浇灌、畜禽饮用、环境除臭等等（稀释比例请参照各领域应用方法）。注意：稀释用水最好是井水，如使用自来水，应放置一昼夜使氯-气散发后使用（下同）。2、制作活性液将EM原液与等量糖蜜（可用红糖代替，下同），按10-50倍不同比例用水稀释后（糖蜜或红糖要先用热水溶化，下同），置于密封容器内厌氧发酵（环境温度20-35℃）。发酵过程中因产气而容器鼓胀，要及时放气。待PH降至3.5左右，并有醇香发酵酸味，表明发酵成功。活性液可与原液一样稀释后使用，但应在一个月内用完。3、制作EM发酵饲料每100份固体饲料（畜禽饲料、水产饲料等）使用EM原液0.1-0.3份，加等量糖蜜或红糖，用20-30份水稀释后均匀拌入固体饲料中，装入塑料袋或容器中密封发酵（温度20℃以上），待出现酒曲醇香气味，即发酵成功。注意：水份含量掌握在一捏成团、一触即散。水份过多易腐败，过少发酵不充分。密闭保存。可应用于畜禽及水产养殖。4、制作EM堆肥牛粪、猪粪等牲畜粪便掺入秸杆、稻壳、锯木屑等吸水材料后，按此方法可发酵制作堆肥。以牛粪为例：牛粪1000kg，秸秆粉或稻壳、木屑100kg，与牛粪混合均匀；EM原液2-3kg，糖蜜2-3kg，水20-30％（视干湿度增减水量），将EM原液与糖蜜溶于水，均匀喷洒在牛粪混合料上，边喷边翻，堆成高40CM、宽约100CM的粪堆后，覆盖上塑料膜，用草帘等适当遮光，中间适当翻堆一两次，等粪堆表面出现白色菌丝并有酒曲香味，即发酵成功。其他材料（豆粕、菜籽饼、酒糟等）亦可按此方法制作EM堆肥。5、制作EM防虫液将EM原液、糖蜜、食醋、白酒(30°以上)、清水按1∶1∶1∶1∶10的比例备料。将EM原液与糖蜜搅匀、装入容器盖紧，发酵2-3天，产气鼓胀后，开盖放气，加入与EM原液等量的食醋与白酒，搅匀盖紧，再发酵两周左右。其间，因产气而容器鼓胀时，要及时放气并立即盖紧，到气体不再产生、能闻到酸甜酯香味时，表明发酵成功。保持密闭，置阴凉干燥处，通常可保存6个月。　EM防虫液能增强植物新陈代谢，强化叶片保护膜的角质层，防止病原菌进入，其酯成分在草食害虫体内不分解，产生生理障碍致死，对线虫等多种害虫有显着效果。但应及早使用，贵在防，虫害大面积发生时用效果甚微。　使用时的标准稀释倍数为1000-500，雾状喷施，叶片正反两面都应喷到。

胰酪蛋白胨（Casein Tryptone）是一种优质蛋白胨，亦称胰酶消化酪蛋白胨（Pancreatic digest of casein），或称胰蛋白胨。该蛋白胨系采用酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。尤其该蛋白胨营养丰富，为生物基因工程高密度发酵技术提供了可能。胰酪蛋白胨质量标准及其检验标准：常规各项理化指标：1.澄清度（磷酸盐、硷性沉淀）：无沉淀、澄清2.2%水溶液：透明3.酸硷度：6－74.氨基氮：≥3%5.色氨酸：≥0.8%6.胨含量：≥80%7.总氮：≥13%8.水份：≤5%9.灰份：≤6%10.氯化钠：≤0.2%胰化蛋白胨是经过胰酶处理，处理后，很多大分子的蛋白分子量变小，这样的话，细菌更容易利用。胰酪蛋白胨（Casein Tryptone)是一种优质蛋白胨，亦称胰酶蛋白胨（Pancreatic digestof Casein),或称胰蛋白胨。该蛋白胨系采用酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好物理性状。可配制各种微生物培养基。

A. 吸附法优点：做作条件温和、简便；成本低；载体可反复使用不足：对离子强度、pH、温度等因子敏感，故酶易损漏，且酶转载容量较小B.共价偶联法优点：载体与酶偶联的方法多样化；固定化的酶非常稳定，损漏少不足：偶联试剂对生命组织多有一定毒性；偶联条件激烈，易引起酶失效；成本较高C.交联法优点：可用的交联试剂多，技术简易；稳定性较高不足：交联条件较激烈，常出现扩散限制，使用有一定难度D.包埋法优点：可进行大量的固定化；包埋膜可选用生物相容材料，并可做成任意大小；胶格包埋用胶可做成所需要的厚度与硬度不足：仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，反应常受扩散限制，不是所有单体材料与溶剂都适用于各种酶

一、实验目的1、学习克隆工作中最-常用的双酶切；2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术；3、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的技术；4、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。5、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。6、学习鉴定重组子的方法。二、 实验原理重组子的建立：采用双酶切质粒载体pBR322和pUC18，酶切后产生了互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下，两个质粒片段连接。感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。转化（transformation）：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最-常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选。三、试剂与器材1、试剂 pUC18质粒，pBR322质粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切缓冲液, EcoR I(15U/ul)及酶切缓冲液，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa)，LB液体培养基(Luria-Bertani) ，LB固体培养基，50mg/ml卡那霉素(kanamycin)储存液，质粒快速提取试剂盒（博大泰克），10 X Buffer K， Pst I，EcoR I (TaKaRa)2、器材 电基因转移议，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪，超净工作台， 微量移液枪，eppendorf管。四、操作方法1．构建重组质粒质粒pUC18和pBR322分别用Pst I和EcoR I双酶切，将酶切产物按照1：1的比例混合，使用T4 DNA连接酶连接，构建成重组质粒。2．制备感受态大肠杆菌细胞收集大肠杆菌细胞，采用CaCl2 处理，制备成感受态细胞。3．重组子的转化将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中，电击法将重组质粒转化到宿主细胞中。4．重组子的筛选鉴定采用蓝白筛选重组子。酚/氯-仿快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定。五、关键步骤与注意事项2．连接反应温度选择要适中，过高粘末端之间形成氢键不稳定，过低会影响连接酶的活性。3．连接反应两种质粒的比例为1：1，否则容易自连。4．制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞，低温处理时间要足够。5．电击法时电击电压、电流、时间选择要合适。6．转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照，防止出现假阳性、假阴性。

（1）原理慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比。一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。（2）服务流程1）含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取；2）慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞；3）培养48~72h，收集培养上清；4）病毒的纯化和浓缩（超离和/或超滤）；5）滴度测定、目的基因检定6）将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞，筛选混合稳定细胞株，并检测靶基因的表达。客户提供1）表达miRNA/shRNA的质粒（提供测序图谱）或所要Knockdown的靶基因的名称、序列；2）所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化3）若需要检测靶基因的表达变化，如需要请提供相应的抗体我们提供1）提供重组后的慢病毒载体质粒2）提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液

一、不同厂家胎牛血清的批号筛选1．动物细胞培养用血清的基本要求用于动物细胞培养的血清，应富含细胞活性物质，尤其有丰富细胞生长因子、维生素、氨基酸等成分，但不能有微生物污染，尤其不能有细胞型微生物。首-选的培养用血清是胎牛血清，其次可以经特定筛选后选择使用某些品牌的新生牛血清或小牛血清。在配液标识的书写上，一般用FCS表示胎牛血清，用BS表示牛血清。由于在血清超滤除菌时，没有细胞壁的原核微生物支原体可能容易通过0.22μm的细菌滤器，甚至通过0．lμm的细菌滤器。考虑到上述因素，使得不同厂家的血清，在细胞生长因子种类与浓度等方面存在不同，残留微生物的风险也不同，即便相同厂家的血清也可能存在批间差异。2．血清筛选方法普通的血清质量筛选方法是利用特定细胞株的克隆化培养进行。选择克隆形成率高的血清批号进行购买。可以比较出不同厂家的血清或相同厂家的不同批号的血清质量差异，购买时尽量选择细胞生长快、克隆形成时间短、无细胞畸形、无微生物污染特别是支原体污染的批号。3．进口血清的筛选原则尽量选择供货量大，使用用户广泛的、信誉良好的品牌产品，如Gibco品牌、ATCC品牌。批量购买前，应做克隆化细胞培养，判断该批号血清的质量水平。购买时，最-好直接向一级代理商订购。如果经手二级、三级代理商订购，很可能由于运输、保存等环节的增加而引入不可预知的风险。如反复冻融多次的血清，其中的细胞生长因子等细胞活性物质将明显缩减，不利于动物细胞培养。4．国产血清的筛选原则尽量选择供货量大，供货历史比较长，信誉良好，使用用户比较广泛的那些厂家进行血清购买前的筛选。批量购买前，务必核实可购买的批号和供货量，并及时做克隆化细胞培养，判断该批号血清的质量水平。购买时，尽量购买一个批号的血清。最-好直接向一级代理商订购，如果经手二级、三级代理商订殉，很可能由于运输、保存等环节的增加，或经手人的细胞培养技术背景薄弱等因素，从而引入不可预知的风险，导致不必要的经济损失，影响实验进程和生产进度。如果不得不向二级、三级经销商购买，务必详细写明订单要求，注明必要的注意事项。二、血清的灭活关于未灭活血清与灭活血清的判识，可以通过仔细阅读所购血清的说明书，或直接联系信誉好的供货商，便可以清楚是否已经灭活。已经灭活的血清在使用前无需灭活处理，否则，需要用户自行按血清灭活方法进行灭活处理方可用于动物细胞培养。血清灭活的主要理由是使血清中含有的补体灭活，以免用于动物细胞培养时发生补体攻击细胞膜，导致所培养的细胞坏死。灭活条件下，也能灭活血清中可能存在的支原体。三、灭活血清的无菌分装与保存灭活后的血清应及时按预计的每次使用量进行无菌分装，减少血清冻融的次数，以免血清中的细胞活性物质受破坏。分装后，加写标识，平衡到室温后转入-20℃冰箱存放。

一、培养用液及无菌试剂的选择哺乳动物细胞体外培养是否正常，关键的影响因素有培养用液配制用水纯度、无菌操作严格程度、培养液选择、试剂选择等方面，其中任意一种因素都可能是致命性的影响，导致不可挽回的后果。下面将简要介绍培养用液及其他无菌试剂的选择原则和注意事项。（一）液体培养基和干粉基础培养基1．品牌选择适用于哺乳动物细胞培养的液体培养基和干粉基础培养基均需从商品供用户选择，着名的品牌如Gibco、Sigma、ATCC等。从Gibco的官方网页可查询到，他们专门为哺乳动物细胞培养、原代细胞培养、干细胞培养、昆虫细胞培养等方面提供了各种套餐式培养基产品服务，关于哺乳动物细胞培养用液的种类非常齐全。另外，为转染也提供配套使用的试剂。转染，也称细胞转化，都是指将外源基因转入感受态靶细胞的方法，转染方法包括共转染、瞬时转染、体内转染、稳定转染、电穿孔法转染、磷酸钙转染和脂质体转染等。2．培养基型号除了选择品牌供应商外，还需特别注意所培养细胞适合的是何种培养液或干粉培养基。如常用的DMEM、RPMI1640、199、MEM等型号。3．包装规格另外，就是选择好培养液或干粉培养基的包装规格，如Gibco的RPMI1640培养基的规格由4种搭配状态：①谷氨酞胺添加状态分为已添加GlutaMAX、已添加L-谷氨酞胺、未添加谷氨酞胺3种情形；②酚红添加状态分为是否添加2种情形；③培养基的物理形态包括固体和液体2种；④提供包括100m1/瓶、500ml/瓶、1L／瓶、5L／瓶和10L／瓶5种包装规格备选。（二）哺乳动物细胞培养试剂哺乳动物细胞培养所需的其他试剂也要从品牌、试剂级别、包装规格等要素进行采购，否则，影响培养细胞的正常生长和活性。1．缓冲液配制用化学试荆或成品缓冲液药片一般要求AR（分析纯）级以上纯度的试剂，无机试剂从国内品牌供应商即可采购到，个别无机试剂和重要有机试剂如DMSO（二甲基亚砜）、BR（生物试剂）建议购买国际品牌供应商的产品，如Sigma品牌的产品。这些试剂都是非无菌包装的，实际使用时需要注意。但是，一般在冻存细胞时，直接取DMSO配制新鲜冻存液而不会污染微生物，因为DMSO本身是不含活的微生物的，DMSO也称万-能溶剂，微生物是不能存活的。利用购买的试剂，按照缓冲液配方配制和滤过除菌或高压蒸汽灭菌都是非常容易控制和操作的。成品缓冲液药片是日常配制常用缓冲液如PBSA,Hank's溶液的便利选择，容易保存。由于使用量偏大，容易配制，不建议直接购买无菌液体包装的缓冲液。值得注意的是，成品缓冲液药片不一定是无菌的，使用时需要注意药品包装说明。2．细胞培养添加物细胞培养添加物包括胎牛血清、生长因子、培养液补充物、培养用抗生素等，这些添加物都是无菌包装的，存放和使用时注意严格无菌操作。有时也使用筛选后适合的小牛血清或新生牛血清替代胎牛血清，目前国内有多个品牌供应商提供胎牛血清。培养用抗生素可直接使用临床使用的产品，如可以采用8×104U/2ml/支包装的硫酸庆大霉素稀释后直接添加到培养液中。细胞培养用的生长因子，以及培养液补充物如L-谷氨酞胺、葡萄糖等，建议从信誉好的制造商产品目录中选择，如Sigma产品。二、培养用液的配制细胞培养用液的配制用水z理想的是去除热原、无核酸酶的超纯水，也可使用新鲜制备的三蒸水、亚沸水或高纯水机制备的高纯水。一般而言，当配液用水的电阻率小于5MΩ·cm时，细胞活性容易受到干扰，如出现细胞形态变异、生长分裂受阻、坏死或凋亡等状况。细胞培养用液配制过程使用的容器、搅拌子等器械，也务必使用配液用水润洗2-3次方可使用。配制溶液过程中，由于开放的烧杯口、容量瓶口、三角烧瓶口均可受到环境粉尘的影响，因此，建议使用新鲜的保鲜膜遮盖开口部分，尤其是为了充分溶解而进行长时间搅拌的过程中。建议配液全程注意，防止粉尘污染所配制的溶液。（一）干粉培养基选择及其液体培养基的配制仔细阅读干粉培养基的包装说明，如lOX1L的包装是指内含10小包，每小包配制1000m1培养液。配制时，适当添加血清以外的其他必需添加物，如抗生素、谷氨酰胺等，一并滤过分装，保存于2-8℃冰箱。严格使用配制培养液的用水，建议使用超纯水或其他新鲜制备的高纯度的纯水，如亚沸水、三蒸水、高纯水机产的高纯水等。使用于分装的玻璃试剂瓶需要提前按要求进行清洗灭菌。灭菌包装完整，保存在洁净间内。（二）常用缓冲液的配制平衡盐溶液即balancedsaltsolution，简称BSS。1.PBSA溶液KCl0.20g,KH2PO40.20g,MgSO4·7H2O0.98g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.16g,CaCl20.20g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。2.D-PBSA溶液KCl0.20g,KH2PO40.20g,NaCl8.00g,Na2HPO4·7H2O2.20g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。3.Hank's溶液Na2HPO4·H2O0.06g,KH2PO40.06g,MgSO4·7H2O0.20g,葡萄糖1.00g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚红0.02g（其中，溶解NaHCO3后，将称量好的酚红一起溶解，均匀后再转移到容量瓶），CaC120.14g，加H2O至1000m1，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。4.D-Hank's溶液Na2HPO4·H2O0.06g，KH2PO40.06g,NaCl8.00g,KCl0.40g,NaHCO30.35g，酚红0.02g（其中，溶解NaHCO3后，将称量好的酚红一起溶解，均匀后再转移到容量瓶），加H2O至l000ml，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃保存。（三）消化液（胰蛋白酶消化液）的配制精-确称取0.25g胰酶蛋白酶（活力为1，250)，加入l00ml不含Ca2+、Mg2＋的D-Hank's或D-PBDA缓冲液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存。胰蛋白酶溶液中也可加入终浓度为0.02%EDTA。（四）冻存液的配制9份10%BS培养液，1份DMSO。无菌条件下配制。DMSO无需滤过除菌，DMSO属于万-能溶剂，不存在微生物污染，是无菌的。但在放入超净工作台内前，需用酒精纱布擦拭外表面的粉尘。

（一）温度哺乳动物及人源细胞培养的最适温度为35-37V，对低温耐受力比高温强。39℃以上的培养环境细胞容易受损，甚至死亡。不低于0℃时（(0-34℃)，细胞能生存，但代谢降低、分裂延缓。（二）气体环境和pH动物细胞培养需要O2和CO2。O2通量过大对细胞有毒害，一般使用空气中的O2含量就可以。CO2则与维持培养基的pH有关，细胞培养的最佳pH为7.2-7.4，通过缓冲系统和调节CO2含量，可维持正常pH。开放培养要求5%CO2环境、HEPES(羟乙基哌-嗪乙硫-磺酸）10-50mmol/ml可防止培养基的pH变化。含Earle's缓冲系统的培养基适合于5%CO2的培养条件，Hank's缓冲系统的培养基仅含有0.35g/LNaHCO3，不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。（三）湿度和光利用多孔细胞培养板、方瓶、培养皿等开放培养时，相对湿度应控制在95％以上。动物细胞培养需避光，紫外线或可见光均可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力。（四）影响细胞生长的其他因素细胞接触橡胶用品，收集细胞时离心速度过大，细胞接种密度过低，细胞悬液或细胞培养物中气泡形成等，均对细胞不利，会导致细胞死亡或生长繁殖抑制。

1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用设施及设备（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。3、培养器皿细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

由于现在国内的细胞库资料不是很充足，而且比较零散，包括建株时的技术层面不一，没有比较严格统一的操作规范，所以在遇到比较重要的实验项目时，一般都比较倾向于购买国外的细胞株，但购买国外细胞株需要考虑的因素有如下几点：1、细胞株的生物等级，由于有些细胞株及菌株属于管制品，所以从国外购货比较麻烦。2、在购买国外细胞株时，需交待国外加比较多的干冰(一般在13公斤以上，采用比较密封的泡沫盒加套纸箱。3、报关时尽量提供比较充足的证明材料，以免担搁时间而导致干冰挥发完细胞株死亡，甚至于被退回给发货人。4、如果通过国外细胞株在国内的代理商购买的话，合同中需注明以下一些内容：a.明确的到货时间，这个时间需注明的是工作日，还是普通日。b.采用什么样的运输方法?c.如果属于技术外的因素而细胞株无法培养活，供方需负什么样的责任?d.细胞株的详细资料，以及细胞株的代数，其中，ATCC的细胞株一般都在几十代,这个需要与国外确认，IST-Banca可与他们的代理商联系索取详细资料。e.需在合同中注明原装进口，避免相关公司鱼龙浑杂，从国外购买回一株细胞株，经过培养传代后，同时供应给几个人；一般国外进口的细胞株都会有原装的冻存管，而且每一支冻存管上都会有批号，而且每次的批号都不一样。f.在决定购买细胞株之前，必须仔细阅读他们的培养信息，所谓“细胞株未到，培养基先行一步”。g.在接到细胞株后，最好要求供应公司的人员现场参与，从而用于确认责任。h.在培养前，请确认您的二氧化碳培养箱二氧化碳浓度的准确性，国外的细胞株建议用进口的细胞培养瓶，比如：orange，corning，falcon品牌的培养瓶。i.询问你的代理商或者经销商，接到细胞株后是否需要离心置换出DMSO，因为有些细胞厂家建议不要离心，他们会认为离心而导致的碎片比DMSO产生毒性的害处更大，如果可以离心，转速不要过高，一般都在1000转以下，此处需要注意，因为有的公司会拿这一点来拒绝索赔。j.培养基的服务，仔细与供应商确认培养基的品牌及份量，以免供应商以些理由来推翻你索赔的理由。k.在细胞株复苏时，一定要先想好步骤再做，一步一步来做，避免导致操作中的污染，复苏是一个非常重要的步骤，往往容易导致污染，然后为污染所导致的杂质而伤透脑筋。

1、方法一试剂：（1）变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB中（42 mmol/L pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/L β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。（2）酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，直到pH。操作步骤：（1）细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4 ℃，3000 g离心5min；（2）细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3000 g离心5 min；（3）细胞破碎：在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆；（4）在经变性液匀浆的细胞或组织600 μl＋60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰浴10-15 min，离心，4 ℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，加等体积的异丙醇，-70℃，30 min沉淀RNA，离心4 ℃，10000 g，20 min；沉淀RNA，冷冻干燥15 min，RNA沉淀重新溶于300 μl变性液中.可振荡（有时为了帮助溶解，可在65 ℃加热，但时间应极短）60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器，600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰裕中10-15 min，离心，4℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30 min），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 mmol/L，再加入2.5体积的乙醇，-70 ℃保存）。2、方法二氯化锂法提取总RNA 方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA-片断丢失的缺陷。试剂：（1）氯化锂/尿素溶液：氯化锂126 g（3 mmol/L）尿素、360 g（6 mmol/L）加水至1 L，过滤灭菌（2）悬浮液：10 mmol/L Tris-HCL （pH7.6），1 mmol/L EDTA （pH8.0），0.5%SDS操作步骤：（1）对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10 ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2 min，对于少量细胞（107细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5 ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中；（2）匀桨液在0-4 ℃放置4 h后，12000 g离心30 min；（3）取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤（2）；（4）沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯-仿/异戊醇在室温放置15－30 min并不时摇动混匀，4000g离心5 min；（5）取上层水相，加1/10倍体积的3 mmol/L乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20 ℃放置1 h，5000 g离心；（6）70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥；（7）RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于-70℃保存。

试剂的有效日期是影响实验结果准确性的重要因素。化学试剂不像食品和药品有严格的保质期，化学试剂一般没有保质期的具体要求和界限，这与化学试剂的保质期受多方面因素影响有关；要根据化学性质、保存条件等，再结合工作的实际情况判断试剂是否出现变质、能否继续使用。化学试剂性质对有效期的影响化学试剂一般没有注明保质期，确定试剂是否变质主要是凭经验和做新旧试剂对比试验。化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。一般遵循以下几个原则（一般原则，不是绝-对原则）：1、无机化合物无机化合物，只要妥善保管，包装完好无损，理论上可以长期使用。但是容易氧化（如亚硫酸盐、苯-酚、亚铁盐、碘化物、硫化物等应将其固体或晶体密封保存，不宜长期存放；水溶液亚硫酸、氢硫酸溶液要密封存放；钾、钠、白磷更要采用液封形式）、容易潮解的物质，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。2、有机小分子量化合物有机小分子量化合物一般挥发性较强，包装的密闭性要好，可以长时间保存（3～5年）。但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。3、有机高分子有机高分子，尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质腐-败，故此，要冷藏（冻）保存，而且时间也较短。4、基准物质、标准物质和高纯物质基准物质、标准物质和高纯物质，原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。在常（15℃~25℃）下保存时间一般不超过2个月。超过两个月要重新标定或检查之后再用。5、培养基培养基：按规定配制并消毒好培养基，冷至室温，保存在阴暗处（尽可能贮藏在冰箱内），配制好的培养基应在1个月内用完。除另有规定外、试液、缓冲液、指示剂（液）的有效期均为半年。液相用的流动相、纯化水有效期为15天。具体要看有机相合水相的比例。除另有规定外，液体试剂开启后一年内有效，固体试剂开启后三年内有效。