1、方法一
试剂:
(1)变性液组成:25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB中(42 mmol/L pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/L β-巯基乙醇),65 ℃溶解,过滤灭菌,4 ℃预冷。
(2)酸性酚配制:55 ℃时,500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L,pH4.0乙酸钠,混匀,静止分层后,去上清,再反复加500 ml 50 mmol/L,pH4.0乙酸钠,直到pH。
操作步骤:
(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4 ℃,3000 g离心5min;
(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000 g离心5 min;
(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆;
(4)在经变性液匀浆的细胞或组织600 μl+60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器600
μl酚\氯-仿\异-戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s,冰浴10-15 min,离心,4 ℃,10000 g,20
min,上层水相吸至无菌离心管中,加等体积的异丙醇,-70℃,30 min沉淀RNA,离心4 ℃,10000 g,20
min;沉淀RNA,冷冻干燥15 min,RNA沉淀重新溶于300 μl变性液中.
可振荡(有时为了帮助溶解,可在65 ℃加热,但时间应极短)60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器,600
μl酚\氯-仿\异-戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s,冰裕中10-15 min,离心,4℃,10000 g,20
min,上层水相吸至无菌离心管中,等体积异丙醇二次沉淀(-70℃,30
min),75%乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中(对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25
mmol/L,再加入2.5体积的乙醇,-70 ℃保存)。
2、方法二
氯化锂法提取总RNA 方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA-片断丢失的缺陷。
试剂:
(1)氯化锂/尿素溶液:氯化锂126 g(3 mmol/L)尿素、360 g(6 mmol/L)加水至1 L,过滤灭菌
(2)悬浮液:10 mmol/L Tris-HCL (pH7.6),1 mmol/L EDTA (pH8.0),0.5%SDS
操作步骤:
(1)对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10 ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2 min,对于少量细胞(107细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5 ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中;
(2)匀桨液在0-4 ℃放置4 h后,12000 g离心30 min;
(3)取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液,重复步骤(2);
(4)沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯-仿/异戊醇在室温放置15-30 min并不时摇动混匀,4000g离心5 min;
(5)取上层水相,加1/10倍体积的3 mmol/L乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20 ℃放置1 h,5000 g离心;
(6)70%乙醇洗沉淀一次,真空干燥;
(7)RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存。
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