API是用于制造药物制剂的活性成分，通常是原料药通过化学合成、半合成以及微生物发酵或天然产物分离获得，经过一个或多个化学单元反应及其操作制成的。原料药的药物合成工艺研究是药物研究和生产的重要组成部分，处于药物研发的基础，是药品质量形成的重要环节。下面来简单介绍以下原料药合成工艺研究中涉及的关键要素。药物合成是药物化学的中心，是药物改造以及验证设计药物的关键，在医药工业中占有极重要的地位。通常优良的药物合成工艺具有以下特点：（1）可行性－采用申报的工艺路线是否能够制备出目标化合物。（2）可控性－ 重现性要好，要能保证不同批次之间，产品质量的一致性，并符合质量标准的要求。（3）合理性－工业化的可行性，工艺路线对原材料、设备、反应条件等的要求；优选低毒性的溶剂、试剂；环境保护和劳动保护；成本核算。1、首先合成路线的选择与设计要有依据，要有合理性。(1)合成路线设计和选择的一般程序包括：a.对拟合成的目标化合物进行文献调研，设计或选择合理的合成路线；b.对所选择的路线进行初步分析，对该化合物的国内外研究情况、知识产权状况有一个总体的认识；c.对所采用的工艺有一个初步的评价，通过以上研究为药物的评价提供可靠依据。(2)对于新的化学实体根据其结构特征，综合考虑：a.起始原料获得的难易程度；b.合成步骤的长短；c.收率的高低；d.反应的后处理、反应条件是否符合工业生产、环保要求； 确定合理的合成路线。根据国内外对类似结构化合物的文献报道，进行综合分析，确定适宜的合成方法。（3）对于结构已知的药物通过文献调研，对该药物制备的研究情况有一个全面的了解，重点关注：a.可行性（原材料是否易得，反应条件是否能工业化）；b.可控性 （反应条件是否温和、易控）；c.稳定性（中间体质量是否可控、终产品质量和收率是否稳定）；d.先进性（所采用路线与文献路线比较的先进性）；e.合理性（成本及原料、试剂、溶剂的价格和毒性等）。2、其次起始原料、试剂和有机溶剂要有标准，强调规范性。对于起始原料的控制，GMP的要求从源头控制产品的质量。（1）对于合成产品有如下要求：a.物料的清单：列出原料药生产工艺中使用的材料（如原材料、起始材料、溶剂、试剂、催化剂）名称，说明各自的使用工序，确认关键物料；b.物料的检测方法：阐明这些物料的质量控制信息；c.关键物料供应商COA：质量标准和检验报告书；以动、植物或其组织器官为原材料的---提供原材料科属种、产地、采集季节、采集物保存条件等，并提供其质量要求生物合成的抗生素要提供菌种科属种和培养基的组成。（2）起始原料的选择原则:a.质量稳定、可控，应有来源、标准和供货商的检验报告，必要时应根据合成工艺的要求建立内控标准。b.对特殊的专用中间体，更是强调要提供相关的工艺路线和内控质量标准。c.对起始原料在制备过程中可能引入的杂质应有一定的了解，特别是对由起始原料引入的杂质、异构体，应进行相关的研究并提供质量控制方法；对具有手性中心的起始原料，应制订作为杂质的对映体异构体或非对映异构体的限度。对原料药合成路线的长短，FDA认为起始物料的确定在制备工艺中，拟定的起始原料应当与原料药的最后中间体间隔多步反应；并且，在间隔的反应中应当有分离纯化的中间体。这样可以有效降低由于起始原料之前的制备工艺变更可能对原料药质量带来的负面影响。应当注意一个反应可能包括多个纯化步骤，但应当视为一步反应。如果工艺中对最后中间体进行分离纯化处理，那么合成最后中间体的反应可以看作一步反应，而游离酸（或游离碱）与盐之间的相互转化则不应看作一步反应。并且要在起始原料中确定一个关键原料，该原料也应在符合GMP条件的车间进行生产。（3）溶剂、试剂的选择原则:　应选择毒性较低的试剂；有机溶剂的选择一般应避免使用一类溶剂，控制使用二类溶剂；应对所用试剂、溶剂的毒性情况进行说明，以便于在生产过程中加以控制。3、最后，合成中间过程要进行控制，强调可控性。对于中间过程的控制分为对制备中间体的质量控制和对工艺条件和工艺参数的选择、优化和控制。（1）对制备中间体的质量控制提供的资料应能够表明如何通过研究确定了关键中间体、一般中间体，如何通过对中间体的不同控制实现过程控制，从而更好的保证终产品的质量包括中间体的纯化方法、内控质量标准、检验结果、对杂质谱的分析。FDA对于主要中间体的归纳分为：a.枢纽中间体：可由不同方法合成的中间体;b.关键中间体：通常是分子中重要部分第一次形成的中间体。如：具有立体异构的分子第一次引入手性原子的中间体。c.最终中间体：原料药合成最终反应的前一步。（2）对工艺条件和工艺参数的选择、优化和控制工艺操作步骤的描述应详细；工艺条件, 如：反应装置、温度、压力、时间、溶剂、p H值、光照等的控制应严格；反应终点（ 提示原料转化为目的生成物的程度、杂质的生成情况等）的判断应明确。原料药制备工艺的研究是药品开发的起点，同时也贯穿于药品开发的全过程。在原料药制备工艺的研究中特别强调重视全过程的控制、数据的积累、杂质分析以及对起始原料和试剂控制的重要性，目的是确定一条可行、可控、稳定的生产工艺，同时也为质量研究提供依据。同时，对原料药制备工艺的评价不是孤立的，应结合质量控制、安全性和有效性的评价进行。从药品审评的角度，希望能对真实的工艺进行评价，以期达到对药物进行合理、全面评价的目的。

由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。流式抗体的选择：1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择蕞基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE蕞强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响蕞后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。流式抗体使用注意事项：1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术 则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。3、尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。

免疫荧光方法中的重要环节1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果蕞佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。 

设备用具：切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。试 剂 ：10％福尔马林、酒精、二甲-苯、固体石蜡、苏木-精、酸水、氨-水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶（二）HE染色石蜡切片的制作过程步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。步骤二：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲-苯中透明，以二甲-苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。步骤五：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木-精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲-苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。步骤六：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木-精水溶液中染色数分钟。②酸水及氨-水中分色，各数秒钟。③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。步骤七：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲-苯使切片透明。步骤八：封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

在产品微生物检测过程中，实验员们会接触到许多不同的微生物种类，小编就来总结下检测实验中常检出的微生物。大肠菌群大肠菌群，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。一般食品中大肠菌群超标，表示食品受动温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。人吃了大肠菌群超标的食物可能会导致：肠道传染病、食物中毒等。霉菌霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。霉菌在我们的生活中无处不在，它比较青睐于温暖潮湿的环境，一有合适的环境就会大量的繁殖，必须采取措施来阻止霉菌的繁殖或切断其传播途径，就可以摆脱霉菌的污染。霉菌毒素对人主要毒性表现在神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌致畸、肝肾损伤、繁殖障碍等。酵母酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，有的为致病菌。空气中、人体中都存在一定数量的酵母菌，只要在合适的环境就会快速繁殖;吃了酵母菌污染的食品易造成食物中毒，有些免疫力低的人群亦可能发生酵母菌感染。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。沙门氏菌沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌主要污染肉类食品，鱼、禽、奶、蛋类食品也可受此菌污染。沙门氏菌食物中毒全年都可发生，吃了未煮透的病、死牲畜肉或在屠宰后其他环节污染的牲畜肉是引起沙门氏菌食物中毒的最主要原因。由沙门氏菌引起的食品中毒症状主要有恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等，还伴有乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、中等程度发热、躁动不安和嗜睡，延续时问2～3d，平均致死率为4.1%。志贺氏菌志贺氏菌即通称的痢疾杆菌。痢疾贺志贺氏菌是导致典型细菌痢疾的病原菌，在敏感人群中很少数量的个体就可以致病。志贺氏菌食物中毒是指由志贺氏菌引起的细菌性食物中毒。引起食物中毒的志贺氏菌主要是宋内氏志贺菌。主要发生在夏秋季，引起中毒的食品主要是热肉制品等。志贺氏菌侵入肠粘膜组织并释放内毒素引起症状。潜伏期一般10-14h。症状为剧烈腹痛、腹泻(水样便，可带血和粘液)、发热、里急后重显着。严重者出现痉挛和休克。溶血性链球菌溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，常引起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：（1）食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；（2）食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；（3）熟食制品因包装不善而使食品受到污染。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。

菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。1、一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。2、菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。3、在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

微生物菌种冷冻干燥和液氮保藏菌种技术一、安瓶管开封1．用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。2．用火焰将安瓿管顶端加热。3．滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。4．用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。二、菌株恢复培养1．用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。2．取0.1～0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。3．若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心，经查证无误后，即免费补寄。三、注意事项1．菌种活化前，请将安瓿管保存在6一10℃的环境下。2．厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。3．某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请将步骤二(2)重复一次。液氮超低温保藏程序1、容器的选择：使用带螺旋盖的2ml塑料安培瓶。2、检查安培瓶是否渗漏：用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30-45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的安培瓶，其余的安培瓶备用。3、打印标签（激光打印）。4、容器的灭菌：先用蒸馏水漂洗干净安培瓶，再用蒸馏水在灭菌锅中121℃浸泡灭菌15分钟，干燥并将打印好的标签放入安培瓶中，略拧紧螺旋盖，再行121℃灭菌30分钟。5、保藏菌菌龄：处于zui大生长量阶段或对数生长期后期。6、保护剂：选用5-10%的甘油或二甲基亚砜作保护剂。1）甘油的准备：在121℃灭菌15分钟，2-8℃贮存。甘油一般以两倍zui终所需浓度的水溶液保存，然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液，则以zui终所需浓度的水溶液保存。2）二甲基亚砜：用0.22um的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜漂洗。无菌的二甲基亚砜以10-15ml装量2-8℃避光保存。7、分装：在无菌条件下，将细胞悬液（从平板上打下直径为5cm的菌块）分装于安培瓶中，并注入保护剂，拧紧螺旋盖。8、将安培瓶固定在铝夹上，贴好标签。为了便于取用，一般一个铝夹上仅放一个菌株。9、将控温系统先预冷到4℃，再将铝夹放入其中。以每分钟1℃降温至-40℃，然后以每分钟10℃降温至-90℃。降温以后，将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。10、菌种的复活：将液氮保藏的菌种取出，迅速放入37℃水浴中解冻。一般需2至2.5分钟,等完全解冻后，再及时转接到合适的培养基中培养。

PCR反应的五要素1、引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC蕞好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端的碱基，特别是蕞末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最hao有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以蕞低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2、酶目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3、dNTPdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4、模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。5、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　实验材料1、活材料：培养3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培养24h的大肠杆菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、培养5d的吸水链霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培养24～48h的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌种；其它自选的微生物材料，包括实验室已有的和自己从环境中分离得到的均可。2、培养基：原则上可以参考以下培养基：完-全培养基、缺C培养基、缺N培养基、缺P培养基、缺K培养基、缺Zn培养基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基、牛肉膏蛋白胨培养液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；也可以自己选定其它合适的培养基。3、试剂： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L柠檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L链霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合适的试剂。实验用品接种环、酒精灯、9 mL无菌水、1 mL无菌吸管、无菌水、无菌平皿、玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸（牛皮纸或黑纸）、紫外灯箱、无菌镊子、直径0.6cm的无菌圆形滤纸片；或其它实验用品。实验设计方案的基本要求本实验是在已经做了微生物的一些基本实验和综合实验的基础上进行的，实验设计方案中应简明地阐述实验目的、原理、材料、实验方法、观测结果以及结果分析等内容。（一）拟订实验目的实验目的应该写明：通过何种设计方案，采用哪种方法，说明哪些因素对微生物生长有影响，影响程度如何；从本次实验本人可以获得哪些收获等等。（二）确定实验原理对自己的实验设计方案、方法从理论上说明依据。如微生物生长需要哪些营养物质，包括有机物、矿质营养元素；微生物与氧气的关系；微生物的生长温度范围；微生物生长繁殖需要的酸碱度即pH值环境；紫外线对微生物的作用；化学药剂对微生物的生长抑制或杀死作用等等，应根据试验目的灵活选择。（三）确定实验材料实验材料应根据自己的实验目的来确定，可以是实验室已有的活菌种，也可以是自己从环境中分离得到的微生物材料。（四）设计实验方法实验方法的确定也应该根据实验目的进行。应该包括菌种的选择、配制何种培养基、需要哪些器材和药品、怎样接种、怎样培养、怎样观察结果等等。可供参考的实验方法如下：1、营养元素对黑曲霉生长的影响⑴制备培养基：本实验分组配制培养基，培养基配方见附录1-8。培养基分装试管，每管装量4～5mL，0.1MPa灭菌30min后备用。⑵孢子悬液制备：取无菌水1支，用接种环从黑曲霉斜面菌种管中挑取菌体2～3环，放入水中，充分混匀，备用。⑶接种：每人取完-全、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培养液各一支，用1 mL无菌吸管按无菌操作法接种黑曲霉孢子悬液0.5 mL。本实验按每4人取一套培养基不接种作为对照。⑷观察：接种后，将培养管置28℃温度下培养5～7d ,观察黑曲霉菌丝及孢子生长情况。★该试验用细菌类微生物作试验菌种能观察到明显的结果吗？为什么？2、氧气对微生物生长的影响⑴菌悬液制备：用接种环按无菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大肠杆菌1～2环分别放入三支无菌水中制成菌悬液。⑵接种：取已熔化并保温在50℃左右的培养基6支，用无菌吸管分别及取菌悬液0.2 mL接种到培养管中，每种试验菌接种2个重复，接种后立即置振荡器上混匀，并冷凝。⑶培养：置培养管于28～30℃下培养3d。⑷结果检查：取出培养管，观察并记录每支培养管的上、中、下各层次中细菌的菌苔大小，菌体集中分布的位置，以了解氧气对几种细菌生长的影响。3、温度对微生物生长的影响⑴接种：取牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基8支，用接种环按无菌操作法分别在斜面上划线接种大肠杆菌与枯草杆菌，勿划破培养基。⑵培养：将已接种的斜面培养基，分别放在4℃、28℃、37℃和45℃四种温度下培养。⑶观察：培养48h、72h后观察生长状况，根据菌苔的大小确定其生长最适温度。4、氢离子浓度对微生物生长的影响⑴培养基制备：分组按下列配方配制不同pH值的培养基，并用pH计校证pH值，然后分装入试管中，每管装量5～6 mL,0.1Mpa灭菌30min备用，见表。⑵接种培养：取供试pH培养基三组用接种环按无菌操作法于试管中分别接入大肠杆菌、吸水链霉菌、黑曲霉。在37℃下培养48h。⑶检查结果：出取培养物，观察并记录实验结果。

　　大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。　　一、接种与分离方法　　根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。　　1．平板划线分离培养法　　对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法：　　（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的?）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。　　（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。　　琼脂斜面接种法　　主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。　　3．穿刺接种法　　此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。　　4．液体培养基接种法　　用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。　　5．倾注平板法　　本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。　　全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2　　每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数　　6．涂布接种法　　本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

支原体污染检测方法一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：1. 试剂盒检测法：目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。2. 观察细胞的形态和生长特征：支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准-确诊断。3. 分离培养法：大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准-确、可-靠，但时间长，敏感性不够高。4. DNA结合荧光素染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准-确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。未污染的细胞、支原体污染细胞、电镜检测支原体污染预防及处理组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保-证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体蕞有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有-效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。支原体污染后果细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。

　　业内周知，混合稳定细胞株具有许多不同的稳定细胞株。因为稳定化的整合过程常常与失活的宿主内源基因的插入同时进行，稳定化的混合细胞株或比较多个单克隆稳定化的细胞株是实验准确数据的基础。由此，我们浅析常见的3种稳定细胞株筛选的发展情况。　　其一、96孔单克隆稀释法筛选稳定细胞株　　96孔单克隆稀释法可用于低整合率的转染法，或用于稳定悬浮细胞系的单克隆细胞系和筛选实验。该方法的优点在于理论上可得到非常均匀的单克隆抗体，且能稳定筛选细胞悬液，是目前筛选稳定且高产率细胞株的理想方法。其缺点是工作量较大，需要大量劳动力来不断的分板、循环筛选稳定细胞株，已达到筛选高产率的稳定性单克隆细胞的目的。　　其二、单克隆环法筛选稳定细胞株　　单克隆环法主要用于整合率低的转染法以及获得单克隆细胞株。单克隆环法具有工作量小的优点，只要把转染体细胞按一定的细胞密度放入新的培养皿，用合适的药物筛选并在培养皿中进行扩增，适合少量劳动力作业，其劣势可能难以获得高产率的稳定细胞株。　　其三、逆转录病毒的混合克隆技术筛选稳定细胞株　　此法可用于制备稳定混合细胞株，其优点在于能在短时间内得到稳定的细胞株，且能在任何时候将细胞稀释成新的培养皿，倾向于整合靠近转录始端的位点的基因，容易激活下游基因，但同时这些整合到转录活性基因的基因很容易导致整合部位基因的插入失效，影响到克隆的纯度。高等细胞株中存在非整合细胞，这种混合细胞内的细胞稳定结合，不会失去生长的优势。

　　细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。　　一、脂质体(Liposome)转染方法原理　　脂质体作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。　　优点:与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性，它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下蕞方便的转染方法之一。　　二、脂质体转染操作步骤　　(1)细胞培养：取6cm细胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃ CO2培养密度至40%~60%，密度过大，转染后不利筛选细胞。　　(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)　　A液：用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。　　B液：用不含血清培养基稀释2ul脂质体。　　分别将A液与B液轻弹混匀，静置5分钟。　　(3)吸取B液加入至A液中，轻弹混匀。室温中置10-15分钟。　　(4)转染准备：用1mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4mL不含血清培养液。　　(5)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。　　(6)瞬时转染后，可在48h-72h细胞长满之后，提取细胞蛋白或者RNA，验证敲减/过表达效率。　　注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

 蛋白酶K在BSE的检测中用来消化PrPc,用来区别致病的PrPsc,它的正确使用对检测特异性和敏感性都有重要影响。概述: 蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶, 具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活, 该酶在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性来源: 源于白色念球菌(Tritirachium album)反应条件: 蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5), 温度范围(37-60℃), 盐浓度(如: 3 M GuHCl)或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如: Tween20(5%), Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性比活性: 30 units/mg分子量: 28.9 kDa单位定义: 在250 μl反应体系, 37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)贮存条件: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃Proteinase K，中文名为蛋白酶K。不含DNase，不含RNase，进口分装，可直接使用。可以用于消化各种蛋白。用于各种常见的分子生物学、细胞生物学等相关实验，例如基因组DNA抽提、酶的消化去除等。酶活力，>30U/mg。在37℃，以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。在很宽的pH范围内有效，有效的pH范围为pH4.0-12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50-55℃。在0.2-1%SDS或约10mM尿素存在的情况下，蛋白酶K显示更高的酶活性。蛋白酶K的常用工作浓度为0.05-1mg/ml，根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。常用浓度的EDTA、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl、盐酸胍对蛋白酶K的活力影响不大。

在基层从事畜牧兽医工作的人士都知道，对动物进行疫病监测是经常要做的一项重要工作。进行疫病监测就要对动物进行采血并制备血清。由于受基层技术条件、工作环境及采集设备等条件的限制，往往基层兽医人员从猪血中分离不出血清。这种情况普遍存在于所有的乡镇、村级畜牧兽医人员当中。现今，市里、县里要求各乡镇场每个季度都要报送动物血清。一些单位只能应付了事。但，由于报送的猪血清不合格而不能很好地完成任务，常常会受到上级领导的责备。的确，制备猪血清有一定的难度。但，只要你掌握了其中的一些技巧，就会轻而一举地制备出合格的猪血清来。如果你有兴趣的话，请接着往下看。1.采集目的及对象1.1用做疫苗抗体监测 要选择接种过待检疫苗且接种期超过一周以上三个月以内的健康生猪。1.2用做疫病监测 可对辖区内所有的生猪进行采血。一般每个自然屯选择两三个点即可。规模猪场及村外养殖小区可增设1—2个采血点。1.3用做自家苗 主要选择某种疫病康复一周以后或接种过某种疫病疫苗一周以上的健康生猪。2.采血部位及方法2.1小猪 一般体重25kg以内的仔猪，主要采集前腔静脉内的血液。其方法是：助手将猪仰卧保定，用碘酒将猪胸前口凹陷处消毒，取无菌注射器使针与猪体呈45°夹角缓缓刺入2-3cm，边刺入边做抽血动作。这样，很容易就会将血液采出。2.2大猪 一般体重在25kg以上的中大猪，主要采集耳静脉血。其方法是：助手用保定器将猪站立保定，术者一手固定一侧猪耳，选择耳面上较粗直的血管用碘酒消毒，用人用点滴软管针刺入静脉，再用试管采集流出的血液。每个试管采集5ml即可。3.血清的析出将试管或注射器（注意：先要将注射器活塞向后拉一两厘米，欲留出血清析出的空隙）放入盛有40°—45°热水的水槽或瓷缸内，并呈30°左右夹角。热水要多一些，并随时用温度计测温。若温度降低则更换新水，使热水浴始终保持在规定的温度内。一般经过30—40分钟，血清即可析出。如果用注射器抽取的，也可将其放在热炕头上（当然，热炕面温度不能太高也不能太低，一般在50°左右即可），并将活塞后拉一两厘米，针头一端垫高一些。再在上面盖上保温棉被或棉垫，经过半小时至一小时左右血清即可析出。4.制备血清失败的原因4.1大多数兽医在采血时一次采集过多，然后将采集的血液又分倒在其他的容器内。4.2热水浴的温度没有保持好。4.3有时还多次地将试管或其他盛血容器从热炕上或热水浴中拿起观看，使血液摇动，同时也造成了局域温度不稳定。5.制备猪血清技巧5.1避免溶血。血样采集完后，不要晃动，尽量保持相对静止状态，斜放在试管架或水杯中。如是用注射器采集的，先将其平放在平板上或水杯中。5.2及时加温。待血样全部采集完后，将其移至热水浴中或热炕上。5.3保持温度恒定。如果是使用热水浴进行加温，应放入一只温度计，观察温度的变化情况。并随时补充新的热水来维持温度的恒定。5.4观察血清析出情况。一般加温半小时后观察一次即可。正常情况下，此时已有少量血清析出。

【目的和要求】1. 了解pH对酶促反应速度的影响。2. 学习测定酶的最适pH的方法。【实验原理】酶促反应受环境pH的影响极为显著。 通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活力，一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于酶的最适pH时，酶的活性逐渐降低。不同酶的蕞适pH值不同。本实验仍以乳酸脱氢酶催化的反应为例，学习测定酶的最适pH的方法。【实验试剂和器材】（一）试剂：1. 不同pH值的缓冲液:100ml 0.33M柠檬酸，100ml 0.33M磷酸，3.54g 硼-酸，343ml 1M NaOH, 加水直到1升。用HCl滴定成pH值3.0、3.5、4.0、4.5直到12的不同pH值缓冲液。2. 0.01M NADH3. 0.1M 丙酮酸钠4. LDH【实验试剂和器材】（一）试剂：0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）；0.01M NADH; 10M 丙酮酸钠；LDH（二）器材：紫外分光光度计 ，移液枪，吸头，1.5ml小离心管，离心管架【实验方法】（一）酶活性的测定：方法同实验7中的步骤1。（二）pH对酶促反应速度的影响：1. 在1.5 ml小离心管中分别加入：(总体积为1ml反应液)2. 混匀以上试剂，倒入比色皿中，然后将比色皿放入分光光度计后读取340nm处OD值，加入0.02ml LDH使用液，迅速搅匀，使反应开始，测定反应1分钟OD值的变化。3. 根据所测得的OD值的变化，计算出反应初速度。

精-确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。依托不同的科学原理，目前已经发展出多种不同的蛋白测定方法，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法（UV），双缩脲法，考马斯亮蓝法（Bradford）、Folin-酚试剂法（Lowry）、BCA（Bicinchoninic Acid）法、凯氏定氮法等等，各有千秋。今天小编就BCA法，Bradford法，2种常见蛋白定量方法的原理、优缺点以及BCA法实验操作步骤给大家做详细介绍，看看哪一种方法能获得你的支持？BCA（Bicinchoninic Acid）法1、原理：BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有蕞高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。2、特点：BCA蛋白质测定方法灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。灵敏度：例如Abbkine的定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，蕞低检测蛋白量达到5ug。优点：BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。缺点：由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应，如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、TCEP和β-巯基乙醇等，结果将受到很大程度的影响。此外，BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。3、实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管4、实验操作：标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。5、浓度计算：在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值，选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。考马斯亮蓝法（Bradford）1、原理：Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G250），是一种甲基取代的三苯基甲烷，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的蕞大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由游离状态下的棕红色变为蓝色。并且在一定浓度范围内，稳定的染料-蛋白复合物的OD值与蛋白质含量呈线性关系。通过分光光度计或者酶标仪以标准品蛋白做标准曲线，随后检测目标蛋白595nm波长处的吸光值，即可换算出目标蛋白浓度。2、特点：简单便捷：仅需一种反应试剂即可完成检测，操作十分便捷，完成一个样品的测定只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性蕞好，不用考虑时间的限制。灵敏度：例如Abbkine的蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，蕞低检测蛋白量达到5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。优点： Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。缺点：由于蛋白-染料稳定复合物之间是分子间作用力，故Bradford法会受到表面活性剂如：去污剂、1N的NaOH 、SDS、Triton X-100，Tween 20等的干扰。除此之外，不同靶标蛋白中碱性氨基酸（范德华力作用）以及芳香族氨基酸（疏水作用）含量不一，对考马斯亮蓝的结合能力差异较大；而且随着蛋白浓度增加，线性关系会出现偏差。注意：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％。检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。通过以上两种蛋白定量的方法的对比，我们可以发现对于BCA法和Bradford法，每一种方法都有自身的优势和缺陷，因此针对同一样本采用不同的方法进行检测，检测结果也可能出现偏差。所以我们在使用时，应当根据实验条件挑选蕞合适的检测方法，这样实验数据才会更可靠!

作为生物科研狗，相信大家都或多或少接触过荧光染料，但或许不是每个人都很了解它。我们今天就来简单说说啥是荧光染料，以及主要有哪些常见的荧光染料。啥是荧光染料呢？荧光染料就是能发出荧光的染料，是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。在吸收紫外线或可见光后，能把短波长的光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。有多鲜艳呢？不多说，直接上图：咋样？漂亮不？荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用。其中复合荧光染料是利用荧光共振能量转移技术合成的荧光染料，由距离非常近、能量可以在彼此间传递的一个供体及一个受体荧光物分子所组成。复合染料在受体分子的激发波长被激发，在供体分子的发射波长发射一个光子。荧光染料发展非常迅速，已开发的用于科研和临床应用的荧光染料已基本覆盖了由紫外到可见光及红外的整个光谱范围 。荧光染料的科研应用荧光染料，由于灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于免疫荧光，荧光探针，细胞染色等。包括特异性的DNA染色，用于染色体分析、细胞周期、细胞凋亡等相关研究。另有很多核酸染料在多色染色系统中是非常有用的复染剂，可作为背景对照，标记细胞核使细胞内结构的空间关系一目了然。    免疫荧光免疫荧光技术( Immunofluorescence technique )，用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，是标记免疫技术中发展蕞早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯将免疫荧光技术又称为荧光抗体技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。    啥是荧光探针（fluorescence probe）？荧光探针是指在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、 强度、寿命、 偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。与核酸(DNA或RNA)、蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。目前常用的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标等。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的应用。我们以后主要讨论荧光素类探针。荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。免疫荧光标记蕞常用的染料有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。荧光染料在核酸检测中的应用核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

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一、概念与临床意义冷凝集实验主要用于由肺炎支原体引起的原发性非典型性肺炎的辅助诊断。参考值：凝集价≤1：32；临床意义：由肺炎支原体感染引起的原发性非典型性肺炎患者的血清中常含有较高的寒冷红细胞凝集素，简称冷凝集素，它能与患者自身红细胞或“O”型人红细胞于4℃条件下发生凝集，在37℃时又呈可逆性完全散开。75％的支原体肺炎病人，于发病后第二周血清中冷凝集素效价达1：32以上，一次检查凝集价>1：64或动态检查升高4倍以上时，有诊断意义。二、实验操作步骤玻璃试管10支，分别加入生理盐水200微升，第一支加入待测血清200微升，混匀后取出200微升加入第二支试管，依次倍比稀释到第九支试管，取出200微升弃去；同时准备好2%“O”型红细胞500微升，操作离心后“O”型红细胞用生理盐水洗涤3次，取离心洗涤后的红细胞100微升加入4.9毫升的生理盐水中即可。最后加入200微升配好的红细胞到10支试管中，混合后放入4℃冰箱中3小时后判断凝集现象。三、冷凝集实验相关知识1、多数正常人体内都有低效价的自身冷凝集素，但效价低，反应温度范围也小，无临床意义。2、有临床意义的自身冷凝集素一般有高效价和反应温度范围高的特点，可致自身免疫性溶血，如CAS.它的发生可能是急性或慢性的。急性常继发于淋巴组织增生如淋巴瘤或肺炎支原体感染；慢性的常在老年人中发生。天气冷时可发生雷诺现象和血红蛋白尿。3、冷反应性自身冷凝集素通常是IgM，当外周循环温度比较低时，结合到红细胞上，并且使得补体致敏红细胞。当红细胞循环回到温暖部位时，IgM从红细胞上放散下来，但是补体被保留着。在循环红细胞上出现的补体成分是C3，有些是C4.所以在几乎所有的病例中，补体是红细胞上唯一要测定的蛋白。4、在极少的病例中冷反应性自身抗体是IgG，它可能不结合补体。如果在DAT的所有阶段在冷条件下进行，使用冷盐水和冷抗球蛋白试剂，否则IgG可能被遗漏掉。5、自身冷抗体的特异性可能是抗-HI、抗-I、抗-i，罕见抗-Pr或其他(Gd，SdX)特异性。

标记免疫技术发展蕞早的一种是免疫荧光，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，接下来的实验方法希望可以帮到您。1. 细胞固定和通透为达到蕞佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。步骤很重要，细胞和抗原需要保证蕞佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，2. 抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。3. 合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。4. 优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。5. 选择正确的二抗如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。6. 使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。7. 多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。8. 降低背景高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为 PBS+0.05%Tween。9. 封片作为免疫荧光的蕞后一步，可以提高折射率，保护样品。10. 数据分析观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。以上就是免疫荧光检测的 10 种方法，希望可以更好的服务于您的实验，为您的实验保驾护航！

ELISA 即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。Engvall 和 Perlmann 于 1971 年蕞先应用该法进行了 IgG 定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA 的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③ 测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其 它物质分开，蕞后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅 进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。ELISA 方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但 ELISA 测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。本文就标本因素对 ELISA 测定的影响做如下讨论。血清是蕞常用的 ELISA 标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：1． 内源性物质有人认为大约 40% 的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体、交叉反应物质和其它物质等。（1）类风湿因子人血清中 IgM、IgG 型类风湿因子（RF）可以与 ELISA 系统中的捕获抗体及酶标记二抗的 FC 段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法有：①用 F(ab)2 替代完整的 IgG；②标本用联有热变性（63℃，10 min）IgG 的固相吸附剂处理（将热变性 IgG 加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用 2-巯-基乙醇等加入到标本稀释液中，使 RF 降解。（2）补体 ELISA 系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其 FC 段的补体 C1q 分子结合位点被暴露出来，使 C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用 EDTA 稀释标本；②用 53℃，10 min 或 56℃，30 min 加热血清使 C1q 灭活。（3）嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将 ELISA 系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物 Ig (s) ，但加入量不足或亚类不同时无效。（4）嗜靶抗原的自身抗体 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在 ELISA 方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。（5）医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体 临床开展的用鼠源性 CD3 等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被 鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠 Ig (s) 抗体。这些病人 ELISA 测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠 Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。（6）交叉反应物质 类di高辛、类 AFP 样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。（7）标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对 ELISA 测定结果有干扰作用。2． 外源性物质外源性物质常常是由于用于 ELISA 测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。（1）标本溶血 由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA 测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。（2）标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。（3）标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中 IgG 可聚合成多聚体、AFP 可形成二聚体，在间接法 ELISA 测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA 测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 天内测定的血 清标本可存放于 4℃，1 周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振 荡。（4）标本凝集不全 在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后 1/2~2 h 开始凝固，18~24 h 完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还 未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况 于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法蕞hao是血液标本采集后必须使其充分凝固后再 分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。（5）标本管中添加物质的影响 抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如 NaN3 可抑制 ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对 ELISA 测定有一定干扰作 用。 综上所述，对临床检验 ELISA 测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除 干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。

今天给大家带来《qRT-PCR》之---如何提取细胞RNA！一、基本原则避免RNA酶污染，全程戴口罩和无菌乳胶手套（汗液和唾液中含有大量RNA酶)二、主要试剂及仪器Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇、DEPC水（或ddH2O)三、操作步骤（全程戴口罩和手套）1、Trizol处理。将细胞培养基吸出后，用预冷PBS洗涤3次，加入1ml Trizol（100mm培养皿），室温裂解1-2min，用移液枪均匀吹下细胞并置于无菌1.5ml EP管，上下轻柔颠倒数次，室温静置5min。2、加入1/5体积氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4度，12000rmp，离心20min。（离心机提前预冷至4度）3、将水相转移至新EP 管（缓吸、宁缺毋滥），加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，室温静置10min，4度，12000rmp，离心15min。4、用真空泵或移液枪小心吸取上清液，加入预冷75%乙醇（无水乙醇配置）， 4度，12000rmp，离心10min。5、弃上清液，EP管倒扣，空气干燥5~10min。6、10~100ul DEPC水 （或ddH2O)溶解。7、NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，读取OD260/OD280比值。若比值在1.8~2.0之间，可进行下一步逆转录反应，若低于1.8，可能存在蛋白污染。8、若暂时不逆转录，RNA置于-80度冰箱保存。

实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：紫外分光光度计法：测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。需要注意的是：在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA可能发生降解。琼脂糖凝胶电泳：完整的RNA通常有三条带，最亮的是28S条带，其次是18S条带，最淡的是5S条带（部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带）。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量最好。若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。上述两种方法在实验室比较常用，此外还有几种检测方式供大家选择。荧光染料检测：通过荧光染料和RNA结合，荧光活性增强。此方法的灵敏度较高，主要用于检测RNA的浓度。微毛细管电泳：可使用软件的RIN（RNA Integrity Number）分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高，可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。3’-5’完整性检测：是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性，主要用于检测RNA的完整性。得到高品质RNA的小建议：1、尽量避免RNA酶污染，使用无RNA酶的耗材和试剂，建议将扩增前后的场所分开。2、尽量减少采样时间，样品处理后快速冷冻，可以加入RNA保护剂。3、RNA提取过程中可以使用RNA酶抑制剂。4、存储过程中避免反复冻融。

许多临床和做科研的小伙伴们都要涉及到细胞培养，在细胞培养实验中，血清无疑成为影响实验成功与否的重要因素，而在众多血清之中，牛血清是最为常用的。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其中含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。牛血清是一种成分复杂的混合物，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。牛血清主要成分有蛋白质，多肽类，激素类，其他成分 如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。我们都知道牛血清根据取材时间不同而有不同的区分。分别有胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。 由于胎牛从未接触过外界， 与新生牛和小牛血清相比，抗体含量明显降低，故抗体与培养细胞发生交叉反应的风险也较低，是理想的细胞生长补充剂。市场上胎牛血清的品牌种类很多，鱼龙混杂，很多科研工作者，特别是刚接触细胞培养的人，难以分辨血清质量的优劣。小编汇总了多家用户和血清经销商以及网络的经验，分析如下：养过细胞的童鞋大都有着这样的共识：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的必备营养，也是细胞死亡的致命毒药，当我们废寝忘食的，呕心沥血的，鞠躬尽瘁的养着细胞同时，也极有可能因为一时的疏忽和大意选错了血清，导致珍贵的细胞意外身外，一切归零，不得不洗心革面重头开始！当血清中内毒素含量≤10EU/ml时，此血清为特级胎牛血清；目前，由于同一厂家，不同批次的血清，内毒素数值也可能有较大差异，因此很多血清厂家在名称上已不注明级别。但使用者仍可通过检测报告，自行甄别挑选。血清融化 专业方法：目的;更好保留血清中活性成分，使细胞培养更稳定。推荐血清融化方法（此方法通用，适用于所有种类的血清）：注意：在水浴过程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化过程中要慢慢摇动瓶身，使血清混匀，但摇动中尽量不要产生泡沫!

作为细胞生长所需的营养物质，血清在细胞培养中的作用不言而喻，而血清的好坏、无菌程度也是决定实验成功与否的关键，那么，怎样对血清进行灭活操作呢，这就需要用到血清瓶。血清灭活操作步骤如下：1、选择一个和血清瓶一样的瓶子作为对照瓶，把对照瓶内倒入和血清等体积的蒸馏水，作温度的测量。2、温度的调节。在对照组的瓶子里插入两个水银温度计，放在水浴箱，在温度计显示56度时候，调节校准水浴箱的温度56度。3、将血清瓶和对照瓶一起放入水浴箱，温度调到56度，水浴半小时，灭活之后分瓶装，做无菌实验，在-70—-20度下保存。4、要观察冰冻血清的颜色和透亮度，颜色偏红或者颜色偏浅有沉淀表示血清质量不好，因此要选择质量好的血清灭活。5、血清的使用要避免多次的反复解冻，会增加血清被污染的概率和降低血清的质量，一但反复解冻的血清出现沉淀那么表示血清不可用或者质量极差。6、为了保证实验的结果的稳定，保证血清分瓶时候要摇匀，然后分瓶，尽量使用同一血清保证统一变量的原则。以上是利用血清瓶进行血清灭活操作的具体步骤，但值得一提的是，在多数的细胞培养中，血清的热灭活并不是必要的。很多场合下，热灭活并不会改善细胞的生长，反而会破坏血清、增加沉淀状况。除非文献指出该细胞必须使用灭活血清，一般细胞培养可省略血清热灭活步骤。

细胞培养是生物研究领域常见的实验方式，由于细胞的敏感性，病原微生物、培养液中杂质、细胞残留及非营养成分的化学物质均会影响细胞的生长，因此，新使用及重新使用的细胞耗材都要进行严格彻底的清洗。细胞耗材主要有玻璃和塑料两种材质，塑料材质的清洗遵循以下步骤：1、实验用完后的塑料细胞瓶、培养皿、多孔培养板等及时浸入清水中6～8 h以上。如残留有较大附着物，可先用脱脂棉擦拭掉，再用流水冲洗干净浸入清水中浸泡。2、将在清水中浸泡好的塑料细胞瓶、培养皿等取出，自来水简单冲洗后，2％NaOH溶液中浸泡过夜。3、佩戴塑料手套取出浸泡过夜的用品，自来水冲洗8～10次，2％～5％盐酸溶液浸泡15～30 min。4、从盐酸中取出用具后用自来水冲洗多次，再用三蒸水漂洗5～6次，倒净器皿内的残水，置37℃恒温箱内晾干。5、紫外灯下照射3 h以上。照射后，无菌存放于储物柜中。一次性3D三维细胞培养仪RCCS-D凡能耐热的塑料器皿，最hao经101．3 kPa(121．3℃)高压灭菌。需要注意的是，塑料材质的细胞耗材进行紫外灭菌时应打开容器的塞子、盖子等，灭菌物品之间不能相互叠放，以充分暴露灭菌部位于紫外灯下，达到良好的灭菌效果。

细胞培养技术发展至今已经非常成熟，细胞生长需要满足环境、温度、渗透压、PH值等各种要求，在各种合成培养基提供基础营养物质之外，还需根据不同细胞和不同的培养目的添加血清等物质，促进细胞生长。所以，血清瓶在细胞培养领域具有较大的应用范围。血清是由血浆去除纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，主要包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等，其中以胎牛血清的使用最为普遍。血清提供的是细胞外基质、生长因子和转铁蛋白等重要物质，要根据不同的细胞和不同的研究目的决定添加血清的比例。10%～20%的血清能维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，添加2%～5%的血清即可，称为维持培养液。由于血清的特殊性，其储存温度应在-5℃至-20℃。血清瓶一般由透明的PET材质经注拉吹技术加工而成，这种材料耐热老化性好，脆化温度为-70℃，在-30℃时仍具有一定韧性，满足了血清的储存需求。且血清瓶都会经过灭菌处理，无热源、无内毒素、无DNA酶、无RNA酶等影响细胞生长的因素。血清是细胞培养不可或缺的物品，随着生物制品、免疫治疗、科研院所等领域的不断发展，对血清的需求量也将随之提高，而血清瓶也将在细胞培养领域也将有更加广泛的应用。

随着基因组学、生物信息学、蛋白质组学等多学科的交叉和融合，分子诊断学技术得到长足的发展。越来越多的分子技术应用于疾病的诊断、疗效监测和预后判断，这为分子诊断学的发展提供了新的机遇与挑战。分子诊断20年，经历三个发展阶段分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。分子诊断学20余年的发展历史，大致经历了3个阶段：(1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；(2)以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量；(3)以生物芯片(biochip)技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等，由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法，不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点，而且具有广阔的应用前景和商业价值，因此成为分子诊断技术领域的一大热点。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术。目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术：PCR技术、基因测序技术和基因芯片芯片技术。划时代的PCR技术  照亮生命科学前进之路PCR技术是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在反应室中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。通过PCR技术进行分子诊断的流程如下：核酸提取——核酸扩增——核酸检测。从各类技术类别来看，PCR技术由于壁垒相对较低，国产化程度高，国内企业布局相对较早，因此基于PCR技术的分子诊断产品占总产品量的70%以上。按照靶标数量划分，PCR技术平台通常可分为qPCR和ddPCR。实时荧光定量PCR(qPCR)：Real-time PCR，美国 PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通PCR相比，实时定量PCR具有许多优点：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板的定量分析。ddPCR(数字PCR)：ddPCR系统利用油包水技术，在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，将此反应体系分割为成千上万个微滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。在此过程中，样品被稀释至单分子水平，并被平均分配到这几万个反应体系中，每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子，这样也相当于变相的对靶基因进行富集。基因测序进入高速发展期 基因技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。经典的Sanger测序技术，被称作是测序届金标准。随着高通量测序技术应用拓展，基因测序技术将不断升级，也将进一步提高占比，成为未来肿瘤检测的主要技术。目前测序市场主流为NGS测序平台。NGS(下一代测序，也被称为“二代测序”)。二代测序在临床领域的应用快速增涨，其在临床上的应用主要包括疾病目标基因集测序(disease-targeted gene panels)、全外显子组测序(whole exome sequencing , WES)和全基因组测序(whole genome sequencing , WGS)。总体来说，NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。第三代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序，单分子测序平台给测序技术带来新思路，部分已经开始商业化推广，但尚未达到NGS的规模。相比二代测序，第三代测序技术在临床上的应用有明显优势：第三代测序技术不需要PCR扩增，可直接对单个分子进行测序;样品制备简单，测序成本进一步降低；可直接读取RNA的序列和包括甲基化在内的DNA修饰。这些优势可以大大改善临床基因测序的成本、速度和质量，但单分子测序有通量限制，所以并不适合独立做全基因组测序，更适于针对有限的、个性化的、目标性的应用。基因芯片技术大有可为基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片类型较为繁多，可以依据不同的分类方法进行分类，一般可分为以下几种：1.按照载体上所添加DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两种。2.按照载体材料分类：载体材料可分为无机材料和有机材料两种。3.按照点样方式的不同可以分为原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片三种。随着二代测序价格的降低，现在这基因芯片技术和基因测序技术的应用重叠度越来越高。基因芯片技术在一些领域逐步被二代测序替代，但是芯片有自己的优势：技术较为成熟，样本处理和数据分析相对测序更加简单、快速，在大规模样本的固定位点基因检测速度上有很大优势，在基因表达检测上对中低表达峰度的基因检测可靠性更高、在基因拷贝数变化的研究方面速度较快，成本相对较低。而微流控芯片技术的引入可以实现检测自动化和一体化，整体效率有较大提升。稿件来源：上海远慕生物科技有限公司附：PCR仪专场基因测序专场基因芯片专场

一般实验室常用的吸头、移液管、PCR管板等都是使用聚丙烯材质，细胞培养板/细胞培养瓶、酶标板或化学发光板一把采用聚苯乙烯材质，而离心管的材质可能会有很多种，以离心管为例看看这些不同的塑料材质都有什么特点。塑料的离心管一般有PP（聚丙烯）、PC（聚碳酸酯），PE（聚乙烯）等材质。PP的管子性能相对来说比较好。塑料的离心管透明或者半透明，可以直观的看到样品离心情况，但是比较容易变形，抗有机溶剂的腐蚀性较差，所以使用寿命较短。PP（聚丙烯）：半透明，化学及温度稳定性较好，但是在低温下会变脆，所以在离心时不要在4℃以下。PC （聚碳酸酯）：透明度较好，硬度大，可以高温消毒，但不耐强酸强碱以及一些有机溶剂如酒精之类。主要用于5万转以上的超高速离心。PE（聚乙烯）：不透明。和丙酮、醋酸、盐酸等不反应，较为稳定，高温下容易变软。PA（聚酰胺）：这种材质是PP和PE材质的聚合物，半透明，化学性质非常稳定，单不耐高温。PS（聚苯乙烯）：透明，硬度大，对大多数的水溶液稳定，但是会被多种有机物腐蚀，多用于低速离心，而且一般是一次性使用。PF（聚氟）：半透明，可以低温使用，如果是-100℃-140℃下的实验环境，就可以用这种材质的离心管。CAB（醋酸丁酯纤维素）：透明，可用于较稀的酸、碱、盐，以及酒精、蔗糖的梯度测定。因此需要根据不同的实验要求选择合适材质的实验耗材，否则，可能带来漏液、破裂等情况，损失宝贵的实验样本，有时还会给昂贵的实验设备造成伤害。