随着基因组学、生物信息学、蛋白质组学等多学科的交叉和融合,分子诊断学技术得到长足的发展。越来越多的分子技术应用于疾病的诊断、疗效监测和预后判断,这为分子诊断学的发展提供了新的机遇与挑战。
分子诊断20年,经历三个发展阶段
分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料,用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常,从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常,以确定受检者有无基因水平的异常变化,对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。
分子诊断学20余年的发展历史,大致经历了3个阶段:
(1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断;
(2)以PCR技术为基础的DNA诊断,特别是定量PCR和实时PCR的应用,不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量,还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量;
(3)以生物芯片(biochip)技术为代表的高通量密集型检测技术,生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等,由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法,不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点,而且具有广阔的应用前景和商业价值,因此成为分子诊断技术领域的一大热点。
通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术。目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术:PCR技术、基因测序技术和基因芯片芯片技术。
划时代的PCR技术 照亮生命科学前进之路
PCR技术是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术,基本原理是在反应室中模拟细胞内的DNA复制,即人为创造核酸半保留复制条件,使目的DNA在细胞外完成扩增的过程。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。通过PCR技术进行分子诊断的流程如下:核酸提取——核酸扩增——核酸检测。
从各类技术类别来看,PCR技术由于壁垒相对较低,国产化程度高,国内企业布局相对较早,因此基于PCR技术的分子诊断产品占总产品量的70%以上。按照靶标数量划分,PCR技术平台通常可分为qPCR和ddPCR。
实时荧光定量PCR(qPCR):Real-time PCR,美国 PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与普通PCR相比,实时定量PCR具有许多优点:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,最终对起始模板的定量分析。
ddPCR(数字PCR):ddPCR系统利用油包水技术,在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理,将此反应体系分割为成千上万个微滴,即成千上万个独立的PCR反应体系。在此过程中,样品被稀释至单分子水平,并被平均分配到这几万个反应体系中,每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子,这样也相当于变相的对靶基因进行富集。
基因测序进入高速发展期
基因技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析,使得DNA序列得以清晰。
经典的Sanger测序技术,被称作是测序届金标准。随着高通量测序技术应用拓展,基因测序技术将不断升级,也将进一步提高占比,成为未来肿瘤检测的主要技术。
目前测序市场主流为NGS测序平台。NGS(下一代测序,也被称为“二代测序”)。二代测序在临床领域的应用快速增涨,其在临床上的应用主要包括疾病目标基因集测序(disease-targeted gene panels)、全外显子组测序(whole exome sequencing , WES)和全基因组测序(whole genome sequencing , WGS)。总体来说,NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点,可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。
第三代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序,单分子测序平台给测序技术带来新思路,部分已经开始商业化推广,但尚未达到NGS的规模。
相比二代测序,第三代测序技术在临床上的应用有明显优势:第三代测序技术不需要PCR扩增,可直接对单个分子进行测序;样品制备简单,测序成本进一步降低;可直接读取RNA的序列和包括甲基化在内的DNA修饰。这些优势可以大大改善临床基因测序的成本、速度和质量,但单分子测序有通量限制,所以并不适合独立做全基因组测序,更适于针对有限的、个性化的、目标性的应用。
基因芯片技术大有可为
基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面,以同位素或荧光标记的DNA探针,借助碱基互补杂交原理,进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。
其测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法,在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
基因芯片类型较为繁多,可以依据不同的分类方法进行分类,一般可分为以下几种:
1.按照载体上所添加DNA种类的不同,基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两种。
2.按照载体材料分类:载体材料可分为无机材料和有机材料两种。
3.按照点样方式的不同可以分为原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片三种。
随着二代测序价格的降低,现在这基因芯片技术和基因测序技术的应用重叠度越来越高。基因芯片技术在一些领域逐步被二代测序替代,但是芯片有自己的优势:技术较为成熟,样本处理和数据分析相对测序更加简单、快速,在大规模样本的固定位点基因检测速度上有很大优势,在基因表达检测上对中低表达峰度的基因检测可靠性更高、在基因拷贝数变化的研究方面速度较快,成本相对较低。而微流控芯片技术的引入可以实现检测自动化和一体化,整体效率有较大提升。
稿件来源:上海远慕生物科技有限公司
附:PCR仪专场
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