一、细胞换液是否需要用PBS清洗我们知道，在“贴壁细胞传代”中，培养基中的血清会抑制胰酶的活性，影响消化的效果，所以必须要PBS 的清洗。但对于细胞换液，尚未查到有资料明确说明是否需要PBS清洗。我觉得这里应该根据细胞的具体情况考虑：1.若细胞比较“娇气”或生长状态不是特别好时，建议还是不要用PBS清洗。一方面，细胞贴壁的状态可能不是很牢固，PBS的冲洗会破坏细胞的贴壁状态；另一方面，PBS可能会洗掉细胞分泌的一些生长因子，这同样不利于细胞状态的调整。如果一定要洗，可以缓慢清洗，减少对细胞的伤害2.当细胞生长状态不错，或者显微镜下观察细胞液中不是很干净时，可以选择用PBS清洗。一方面可以去除积累的代谢物；另一方面，也可将一些生长状态不好或衰老的细胞洗脱下来，保持细胞活力。二、什么是“细胞半换液”“细胞半换液”又称“细胞半量换液”，即弃掉一半旧的培养基，再加一半新的进去。选它的原因其实与前面不加PBS的理由有点相近。其原因包括：1.给细胞提供适应的缓冲环境；2.细胞生长过程中可能会分泌某些生长因子，促进生长。3.节省材料4.方便操作：比如96孔板，换液很麻烦。所以常采用排枪进行半换液5.对于悬浮细胞的培养，有时也会选用半换液减低细胞密度

1.目的管理好标准溶液及试液，保证化验正常运行。2.适用范围适用于标准溶液的配制、标定及试液的配制。3.责任者化验员应严格遵照该操作规程,QC主管负责监督本规程的实施。4.定义USP美国药典CP中国药典VS标准溶液6.规程6.1.标准溶液的配制及标定如无特殊规定，应严格按照USP25或CP2000规定的方法操作。6.2.每批标准溶液应有明确的批号，其批号建立规则是VSxxxx(年)xx(月)xx(顺序号)例：2000年5月标定的第1批标准溶液，其批号VS20000501。6.3.使用专用的标准溶液配制及标化记录，记录应整洁，完整，准确，及时。6.4.标定溶液实行双人复核制，第一标定人标定后，由另一人独立操作复核标定，如无特殊规定，单人相对标准偏差应在0.1%以内，两人相对标准偏差应在0.2%以内，否则应重新进行标定。6.5.标定人对标定结果负责，批准人负责审核计算结果并批准标准溶液的使用。6.6.标准溶液如无特殊规定，一般有效期3个月，并应每次使用前检查外观，必要时进行复核标定，对于常用标准溶液在有效期前应配制新溶液并标定，对于不常用和不稳定的标准溶液，可随用随配制或标定。6.7.标准溶液标签应明确标有名称，克分子浓度，标定温度，标定日期及失效期等项目。6.8.试液的配制方法如无特殊规定，一般采用USP25方法，若采用中国药典2000版方法进行化验，应采用中国药典的方法配制溶液。6.9.试液的有效期如无特殊规定，一般为半年，并应经常检查。如外观发生变化，应停止使用，并重新配制试液。6.10.以易挥发有机物作溶媒的试液，可用合适的磨口瓶塞或胶塞防止溶剂挥发：对有恶嗅的应封好瓶塞存放于通风厨内。6.11.试液标签应明确标有名称，配制方法(USP或CP)，配制日期，配制人，必要时标明所用溶媒。每瓶溶液应有明确的溶液编号，其编号建立规则是xx(年)xx(月)xx(日)xx(顺序号)例：2001年2月3日配制的第1个溶液，其溶液编号为01020301。7.参照  《中国药品检验标准操作规程》 USP25 CP2000

　　通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。　　（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。　　（2）改用不依赖CO2培养液。　　（3）松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM终浓度。　　（4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。　　（5）如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

细胞培养所需添加物通常细胞体外培养时需要加入血清，以维持细胞的生长和存活。而除了血清之外，部分细胞在培养过程中需要添加胰岛素和β-巯基乙醇等成分来维持细胞状态。MCF-7和NIH:OVCAR-3等细胞需要额外添加胰岛素，而Thp-1和MC3T3-E1 subclone 14等细胞则需要添加β-巯基乙醇，不同细胞加入量会有差异，需根据细胞类型判断。胰岛素作用广泛，包括调节脂肪和蛋白质的代谢以及促进细胞生长等。胰岛素功能的发挥源于其对细胞的作用，进而引起组织乃至机体的整体反应。一般可将胰岛素在细胞水平的作用分为三大类：代谢作用、促生长作用、以及代谢和促生长混合作用。胰岛素对细胞的代谢调节作用主要是通过其与细胞膜上的胰岛素受体（Insulin receptor, IR）相互作用而介导，而胰岛素对细胞的促生长作用则是通过其与细胞膜上胰岛素样生长因子受体（IGF Receptor, IG）相互作用而介导的。在无血清细胞培养液中，常添加胰岛素来维持细胞生长，调节细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的摄取、利用和贮存，同时抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。细胞生长分裂的过程中会释放氧自由基，而氧自由基累积到一定程度会破坏细胞膜和细胞器膜，从而杀死细胞。这使得细胞达很难达到实验所需的融合度，从而影响实验的数据。β-巯基乙醇作为一种强还原，中和细胞培养基中积累的氧自由基从而改善细胞周围环境。β-巯基乙醇在溶液中不稳定，因此需要定期添加。本公司产品β-巯基乙醇用DPBS稀释，浓度为50mM。例如：Thp-1细胞β-巯基乙醇终浓度为0.05mM，因此使用时需根据细胞培养要求添加。丙酮酸钠是最常见的丙酮酸盐，是一类内源性小分子物质，丙酮酸钠和丙酮酸均是天然存在于人体内，并参与全身各组织和器官的代谢。丙酮酸钠在医学上、诊断试剂以及医疗器械中被广泛用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。在人体中行动中大多数细胞只利用葡萄糖作为能量的物质就够了，而在细胞培养中丙酮酸钠是必须的物质。丙酮酸钠在培养基中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢。Hep G2，Caov-3及 NCI-H1395细胞培养基中就需要额外添加丙酮酸钠，以维持细胞良好的生长状态。L-谷氨酰胺是细胞生长的必须氨基酸，可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中状态不稳定，它的降解速率随保存时间，保存温度及保存环境pH值等变化而变化。L-丙胺酰-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine）是细胞培养中广泛使用的L-谷氨酰胺的替代品，其在水溶液中稳定性高，即可保持长时间稳定的营养供给，也降低了分解产物造成的细胞毒性。L-丙胺酰-谷氨酰胺溶液可作为哺乳动物贴壁细胞或悬浮细胞培养添加剂。与谷氨酰胺相比，L-丙胺酰-谷氨酰胺不会自行降解成氨而导致细胞毒性，作为添加物培养条件更加可控，可有效提高细胞活力。保持细胞生长良好状态的法宝当属抗生素，适量浓度的的抗生素可有效防止微生物的污染。青霉素-链霉素混合溶液（Penicillin-Streptomycin Solution, 100×）是专门用于细胞培养的双抗，抗菌谱：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液也是可用于细胞培，抗菌谱：细菌、真菌和酵母。细胞培养需要了解不同细胞生长特性，还需要及时补充各类营养物质以保持细胞良好的状态。

常规的PCR扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增,操作繁琐耗时较长,同时在反复的操作中DNA量损失也较大,产率较低。在1989年  Gussow Clackson3建立了菌落PCR( colony  PCR)法,菌落PR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落,操作简单,快速,在转化鉴定中较常用。PCR原理常规的PCR需要专门制备DNA模板,面菌落PCR可直接以单个菌落作为模板,用无菌牙挑取单个菌落到TE级冲液中,煮沸10mn,涡旋振荡后短暂离心,用1-2pl裂解液作为DNA模板,省去抽提模板DNA这一步,通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增大大节约了时间和成本材料选择1.固体平板培养基上培养出的单菌落②10XPCR缓冲液(100mmol/ L. Tris-HCL, pH8.3,500 mmol/L KCL;0.1%明胶;15mmol/LMgCl2)。③目的基因引物④高压灭菌牙签⑤抗性平板。⑥ Triton x1007.EP管8.离心机操作方法①用高压灭菌的牙签挑取单个菌落,先在含抗性的平板上画线,做保种用,然后将牙签置于2  Intar×100中搅和一下,以便悬浮涂在牙签上的菌,将相应的菌和平板上的画线区做上对应的②将装有20 u  Triton×100的EP管煮沸10min,冷却后120r/min离心lmin去除细胞③反应体系(25ul)Taq酶(5U/ul） 0.5ul 引物P2(10umol/L） 0.5ul10×Taq缓冲液 2. 5ul dNTPs(各 2. 5mmol/L) 2ul模板引物Pl(10mo/L) 0.5ul④PR扩增条件:95℃ 5min 94℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 60s,30循环;72℃5min;4℃⑤电泳,观察结果,对阳性的结果相对应的主平板上的菌落保种或者进行测序。注意事项①菌落PCR时,加入菌液模板的体积不能过大,否则会影响PCR体系,导致扩增失败,般取1~2l做25l的PCR体系,模板如果太多了,引物就不够用了,显然扩增不出来,这种现象在以质粒为模板的PCR里面很多,提出来的质粒不要忘记稀释②减少扩增循环,25-30个循环对于菌落PCR是比较合适,扩增循环过多,会产生假③假阳性的控制。如果用载休引物来扩增一般可以降低假阳性,或者多用几对不同的引物扩增,以增加真阳性的筛选结果,PCR结果最好做酶切鉴定④PCR条件的控制。热启动可以消除引物二聚体,退火温度可以低PCR应用1.挑取重组子克隆常规的碱裂解和煮沸法(   Sambrook,1989)12均需要经过菌体过夜培养、菌体裂解及乙醇沉淀过程。一般情况下,在挑取的若干克隆中只有少部分为重组子,因此提取质粒过程消耗的时间很多,而利用菌落PCR挑取重组子克隆的过程则避开了提取质粒的繁琐过程。陈淑霞等人口利用单菌落PCR法直接筛选含有绿色荧光蛋自基因(  green fluorescent protein,GFP)和不耐热肠毒素B亚基和耐热肠毒素融合基因(  LTB-ST)外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增进行比较结果一致。证明单菌落PCR进行重组菌阳性克隆的鉴定是非常有效的2.基因组测序传统的测序首PCR扩增是以碱裂解等方法抽提的DNA为模板,成功率高但较为繁琐,采用菌落PCR方法,将样品跳过DNA抽提这一步,直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增和荧光标记,使建库到测序前各步骤的总成本减少了1/3,唐晔盛等釆用该法成功测定了籼稻(  Oryza sativa indica)广陆矮4号的L173号 BAC DNA全长序列总结常规PCR技术是目前分子生物学中的一种常用的鉴定方法和技术手段,在严格操作的前提下,PCR的结果是十分可靠的,但常规PCR扩增需要一些前期准备工作,如DNA模板的制备与纯化,操作繁琐,耗时费力,成本较高,而且DNA制备过程中的某些试剂会对扩增带来不良影响。因此,菌落PCR为简便快速地筛选DNA阳性重组克隆以及大规模基因测序等提供了一个简便、高效的途径.

中文名称：大肠杆菌DH5α化学感受态细胞英文名称：E.coli DH5α Chemical Competent Cell产品规格：0.1mL*10本产品是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。DH5α是一种常用于质粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。使用pUC19质粒检测，转化效率不低于107，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。本菌种来源于Hoffman-Berling 1100菌种。基因型表现型deo R组成型合成脱氧核糖end A1核酸内切酶I缺失gyr A96具有萘啶酮酸抗性hsd R17限制性酶EcoK缺失△(lac)U169lac基因缺失rec A1DNA重组活性降低Rel A1允许在无蛋白质合成时有RNA合成sup E44抑制琥珀突变突变，为某些噬菌体必需thi-1不能自身合成硫氨φ80(lac ZΔM15)提供α-互补所需的ω片断储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。使用方法：1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μL感受态细胞为例。2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。3. 42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。4. 每个离心管中加入800μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，200rpm(小于225rpm)振荡培养45分钟使菌体复苏。5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。注意事项：1、涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm ，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。2、新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。3、涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

 　　胎牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。是胎牛血清中的一种球蛋白，一般获取胎牛血清白蛋白，常常运用的方法是加热法。　　下面一起来看看是怎样获取胎牛血清白蛋白的！　　一、所需材料　　胎牛血清以柠檬酸三钠为抗凝剂，血液搜集后随即分别出血浆备用。需要的试剂有血清白蛋白；溴jia酚氯；醋酸纤维素薄膜，别的试剂均为分析纯。获取胎牛血清白蛋白需要准备 LG-6型大容量冷冻离心机，DF-C型电泳仪，UV-754型紫外可见分光光度计，PHS-2型酸度计。　　二、具体方法　　白蛋白含量测定 选用溴jia酚氯法，以胎牛血清白蛋白为规范. 白蛋白纯度的测定 选用醋酸纤维素薄膜电泳法。吸光度值的测定 用分光光度计直接测定蛋白质溶液在波长为403 nm处的光吸收值，然后折算成浓度为10 g/L时牛血清白蛋白的光吸收值，用A403表明。　　胎牛血清白蛋白的生产工艺 新鲜抗凝牛血用LC-6型大容量离心机(3 000 r/min×30 min)离心分别出血浆，加一定量的蒸馏水稀释，再参与恰当的稳定剂和蛋白沉淀剂，然后按下述方法进行试验处理：　　1.不一样pH值溶液对白蛋白的收率和质量的影响 在其它条件固定的情况下，试验不一样pH值对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响。　　2.不一样加热保温时间对白蛋白的收率和质量的影响 在选定的pH值和其它条件固定的情况下，试验不一样加热保温时间对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响。　　3.不一样稀释倍数对白蛋白的收率和质量的影响 在选定的pH值和保温时间及其它条件固定的情况下，试验不一样稀释倍数对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响。　　4.不一样加热温度对白蛋白的收率和质量的影响 在其它条件选定的情况下，试验不一样加热温度对白蛋白的收率、纯度及A403值的影响。 

　　距离龙年春节还剩不到半月的时间，首先感谢您对远慕生物一直以来的支持。在您的支持和信赖下，我们才得以在激烈的市场环境下不断进步！希望在新的一年里,能继续得到大家的关注及支持,我们也会一如既往地为您提供更优质的服务！　　根据国家法定假期的规定，并结合公司实际情况，决定春节放假时间定为2024年02月2日至2024年02月19日，于2月20日(星期二)恢复正常上班。如有需要订购的客户请提前下单以免耽误您的宝贵时间。　　由于放假给大家带来的不便,敬请谅解！远慕生物携全体员工恭祝您新春快乐、身体健康、工作顺利、财源广进！　　远慕生物

Effects of the triple therapy of carnosine glycoside, edaravone, and Xueshuantong in hemorrhagic cerebral infarction影响肌肽糖苷的三联疗法,药物不良反应,Xueshuantong在出血性脑梗塞IF：2.2摘要目的:本研究旨在评估的影响肌肉氨基酸和肽的三联疗法,核苷(MAAPN),药物不良反应,和Xueshuantong神经功能、肿瘤体积,出血性脑梗死患者的不良反应。方法:回顾性研究中,共有115例出血性脑梗死患者从2020年1月到2021年1月住院登记和分配给观察组(n = 57)和对照组(n = 58)根据不同的治疗方法。两组均接受常规治疗,观察组是另外鉴于肌肽,药物不良反应,和Xueshuantong,疗程14天。神经系统和运动功能和脑水肿和脑梗塞病灶大小的变化对患者进行评估。炎症因子的水平,血脂、特异性神经元烯醇酶(研究)、s - 100 -β,矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)两组测定和比较。的不利影响和再出血患者记录。Barthel指数(BI)被用来评估患者的生活质量。结果:观察组治疗效率显著高于对照组(P 该文献引用远慕产品如下：人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒 YM-S0122TNF-α检测原理：预先包被的抗体为TNFα单克隆抗体。检测相抗体为TNFα多克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNFα呈正相关。人组织因子(TF)ELISA试剂盒 YM-S0136TF 简介：组织因子，又称血小板组织因子、因子III或CD142，由F3基因编码的蛋白质，存在于内皮下组织和白细胞中。它在凝血过程中的作用是由酶原凝血酶启动凝血酶的形成。凝血酶定义了导致X因子激活的级联-组织因子途径。这样一来，它就取代了以前命名的外源性途径，以消除歧义。正常情况下,组织因子位于血管壁外膜细胞,包绕血管的成纤维细胞,肝、脾、肾等器官的纤维囊,及皮肤外层的表皮细胞、肾小球上皮细胞、脑皮质、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、胃肠道壁、部分生殖泌尿道和子宫内膜基质细胞中,而在血管中膜或内膜层却很稀少。因此在正常情况下组织因子不存在于循环中或不与循环血液接触,只有当血管壁的完整性遭到破坏时TF才暴露于循环血液,通过激活凝固级联反应发挥止血作用。人谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA试剂盒 YM-S0456GDH检测原理：将目标抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的目标连接于固相载体上的抗体结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，将未结合的抗体洗净后再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

操作方法一：1．以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。操作方法二：1．根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15%。5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。操作方法三：1．培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。

菌种在分离、保藏和生产过程中，极易遭致杂菌污染，因此必须对染有杂菌的菌种进行提纯，方能用于生产。根据污染的类型和程度，需采用不同的纯化措施。（1）排除细菌或酵母菌污染在菌种培养中，用肉眼仔细观察培养基表面，不难发现被细菌或酵母菌污染的分离物常出现黏稠状的菌落。取被纯化物接种在无冷凝水、硬度较高（琼脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培养温度至15～20℃，利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的前端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。也可打破试管，挑取内部长有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上，该法适于被好气性细菌污染的母种。（2）排除霉菌污染霉菌和细菌不同，它和食用菌菌丝很相似，也有气生菌丝和基内菌丝。分离的方法主要是抑制杂菌生长，拉大食用菌菌丝生长和杂菌菌丝生长的范围差，从食用菌菌落前端切割，移植入新培养基。杂菌发现越早，分离的成功率越大。严格地说，在斜面培养基上的非接种部位发现的白色菌丝，应认为是杂菌菌落，应马上提纯。若有色孢子已出现，一方面易使分生孢子飘散，另一方面其基内菌丝早已蔓延，可能和食用菌菌丝混生一起。如霉菌刚出现孢子且尚未成熟、变色，则可采用前端菌丝切割法提纯。转管时先将菌丝接种在斜面尖端，当长满斜面后，及时将原接种点连同培养基一起挖掉；如霉菌菌落颜色已深，说明孢子已成熟，稍一振动孢子就会飘满培养基，若再行上法意义不大。如菌丝蔓延范围较大，可将0.2%升汞溶液或1%多菌灵处理过的湿滤纸块覆盖在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生长，防止孢子扩散，后用灭菌接种铲将表层铲掉，随之用接种针钩取基内菌丝移入新的培养基，如此2～3次。（3）限制培养取直径7～10毫米、高4～6毫米的玻璃环或不锈钢环，经酒精灯火焰灼烧后趁热放到斜面培养基中央，将环的一半嵌入培养基内，然后将染有细菌的接种块放入环内进行培养。细菌生长会被限制在环内，而食用菌菌丝则可越过环而长到环外的培养基上，转管后即可得到纯化。（4）覆盖培养在污染了细菌的食用菌菌丝斜面上倾注一层厚约2毫米的培养基，培养一段时间，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可切割转管。最好进行二次覆盖。（5）基质菌丝纯化培养对棉塞长有霉菌的试管斜面，可将试管打碎，取出培养基，用0.1%升汞浸泡2分钟，用无菌水淋洗，再用无菌滤纸吸干。取一段2厘米的培养基从中部切开，在断面上用无菌刀片切成米粒大小的块，移入新的斜面上进行培养。（6）药物处理菌种提纯时，可向培养基中注入选择性强的抗菌制剂，如加入 5～10毫克/升的多菌灵（MBC）、涕必灵（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培养基中加入30～40毫克链霉素、20～30毫克四环素、金霉素，或50毫克高锰酸钾，可以有效地防止细菌混生；加入灰黄霉素（20单位/毫升），可抑制真菌生长。（7）破碎菌丝从试管中取出已污染的培养基，放在0.1%升汞水中处理2分钟，用无菌水冲洗，无菌纸吸干，再放入有玻璃珠的无菌水内，经组织破碎，稀释后注入平板培养，取其单个菌落纯化培养。

　　稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达，这样的细胞系称为稳定细胞系。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中，常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)等。通过筛选可得到符合实验要求的稳定高表达目的蛋白细胞株或者稳定沉默目的基因的细胞株。　　其建立的原理是，将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上，随着细胞的生长繁殖，目的基因可以稳定的表达，在通过抗生素的不断加压筛选，得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染，稳定转染技术持续周期长，细胞整合稳定，能够满足后期对蛋白的大量需求。　　以下情况需要使用稳定细胞系：　　1、实验周期长，要求外源DNA在分裂细胞中长期表达，>2周。　　2、需要构建诱导表达系统。当目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性，或者会引起细胞毒性等不利影响。　　3、基因敲除/插入等修饰宿主细胞基因组的实验。　　4、筛选拷贝数适宜的细胞。　　5、对于某些很难转染的细胞种类。即使病毒载体也无法实现高效率转导。　　6、通过构建稳定细胞株实现更好的基因干扰效果。　　7、后续实验中需要将转染细胞注射进入动物体内。　　8、需要构建单克隆细胞株可以去除个体差异。

在组织学中，石蜡切片和冰冻切片都是常用的方法，前者常用于进行免疫组化实验，后者则常用于免疫荧光实验。组织学常规制片技术中最为广泛应用的切片方法，为石蜡切片与冷冻切片。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，为永久性显微玻片标本。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法。多应用于手术中的快速病理诊断。而且也被用于其他许多学科领域的研究中。冷冻切片技术，是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。被称为病理科的急诊工作----在外科手术过程中，医生切取部分肿瘤组织或其它病变标本，送检到病理科通过快速冷冻标本制作切片，病理科诊断医师对该切片进行观察快速做出判断得出良、恶性结果或某种疾病的诊断。冷冻切片与常规石蜡切片有什么区别呢？远慕简单介绍一下：1、制作方式不同：①冷冻切片要求送检新鲜组织，采用低温恒冷切片机，将取材组织置于-25℃冷冻箱内速冻3-5分钟，切8微米厚度切片，固定后水洗直接染色，针对不同组织采用不同温度进行切片。②石蜡切片--送检组织用10%中性福尔马林固定，标准取材后，置入全自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，再进行包埋、切片，厚度3-5微米，将切片烤片后，置入全自动染色机进行染色。2、镜下观察不同：①冷冻切片---因为冷冻组织未经过固定是新鲜组织冷冻切片，没有经过充分的脱水，对组织的观察会有一定的影响，所以切片镜下细胞、组织略显肿胀，诊断准确率95%以上。②石蜡切片---因为组织块经过10%中性福尔马林固定，酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，所以切片平整、颜色鲜艳、细胞组织结构清晰可见，诊断准确率99%以上。3、用途不同：①冷冻切片用于术中病理诊断，达到迅速做出诊断，包括良、恶性、切缘及淋巴结转移情况。所以要求病理诊断医师具有高年资病理诊断经验，取材部位精准， 病理技术人员具有冰冻切片的经验。②石蜡切片用于术后病理诊断，要求离体组织及时固定，保持组织原有结构及成分固定在原有位置，经过一系列技术处理，通过这些处理可以使得切片在显微镜下清晰的辨认其形态结构，组织细胞形态结构保存良好，可以帮助医生更加准确的做出诊断。由于冷冻切片存在质量和时间上的限制，冷冻切片病理诊断对肿瘤的分型不一定非常准确，对部分无法确定组织学类型的病/例，还需要等待常规的石蜡切片予以确诊。冷冻切片较石蜡切片制作厚，做出来的切片没有石蜡切片清晰。总之，简单概括起来，两者之间最大区别是冰冻切片操作便捷性高，能很好保持抗原活性、脂肪、类脂成分。石蜡切片组织形态好，能切更大组织，切片厚度薄，连片性好，对标本的长期保存非常适合。

Treatment of porcine ovarian follicles with tert-butyl hydroperoxide as an ovarian senescence model in vitro治疗猪卵泡与叔丁基氢过氧化物作为卵巢衰老模型IF: 5.2文献介绍：卵巢衰老是女性生殖问题的主要原因。过度氧化应激可以诱导卵巢衰老和卵泡闭锁,从而减少繁殖性能。毛囊被分成五组文化基于刺激的持续时间与叔丁基氢过氧化物(t-BHP)阀门组和组1 h, 2 h, 6 h,和12 h。结果显示,孕激素的比例(P),雌二醇(E)增加24和36 h后的卵泡文化,转变对闭锁卵泡(引用产品：猪雌二醇(E2)ELISA试剂盒产品货号：YM-S2619猪雌二醇(E2)ELISA检测试剂盒原理：酶联免疫吸附测定是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗原（抗体），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。我司所有产品仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用。

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程25px)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9)HRP(RZ>3.0)。(10) Sephadex G-25层析柱(50px×1250px)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸钠法本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:Na２CO３ 0.32克NaHCO３ 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４0.05ml终止反应。结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。(四)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。

细胞培养是细胞生物学研究方法中最常用也是最重要的技术之一，在现代医学、生物科学、农业科学等领域被广泛应用以提供研究模型和实验材料。在细胞培养过程中，完全培养基对细胞生长状态起到关键作用，决定实验成功与否。而血清是完全培养基中的关键成分之一，除为细胞生长提供基本营养物质、结合蛋白、一些参与解毒代谢的微量元素和可起到中和保护的酶类之外，还可以保护细胞免受机械损伤，因此被业内认为是细胞增殖过程中最重要的试剂。在生命科学领域的细胞培养技术中，动物血清的应用十分广泛，特别是牛来源血清。而牛源血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它们的区别方式主要由于牛龄和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗体水平含量低对后续实验结果影响小、生长因子含量水平高利于细胞增殖而应用最广。因此关注胎牛血清的品级、质量以及使用过程的一些注意事项，会对实验结果起到直接影响作用，并可以确保科研人员在实验操作过程中的安全性。今天我们就来看看在细胞培养过程中血清使用方面常见的问题，如：血清储存条件、如何程序解冻、细胞污染与血清之间的关系、传说中的“黑胶虫”是什么以及血清热灭活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通过今天的解析与学习可以让我们在做细胞培养相关实验时事半功倍！Q1：血清长期储存的条件和方法是什么？A1：血清如需长期保存，则必须储存于-10℃或更低温冰箱中，建议存放于-20℃的冰箱中。研究表明储存在-80℃条件下的血清在性能方面变化不大，但由于解冻时温差过大，会导致析出更多沉淀，使得背景杂乱，因此血清长期保存不建议处于-80℃条件下。如果近期会频繁使用血清，我们建议不要在4℃条件下存放超过1个月，若一次无法用完整瓶建议分装后保存，且要避免反复冻融。另外，血清冰冻后体积会增加约10%，因此血清分装时请留意预留一定的体积空间。Q2：如何进行血清的程序性解冻？血清才不会使产品质量受损？A2：程序性解冻血清可以确保血清制品质量的稳定性，且不会因为温差过大而析出过多蛋白等沉淀。程序性解冻方法是于实验开始之前将冷冻的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解冻过程中每隔1小时摇匀一次，使温度与成分均一，减少沉淀析出，直至全部解冻，然后再移入室温条件下使用。Q3：血清解冻后发现絮状沉淀该如何处理？A3：造成血清发生絮状沉淀的原因主要是血清解冻过程中温差带来了脂蛋白变性和纤维蛋白析出，沉淀本身不会影响血清质量，也不会对实验结果造成影响。但如必须处理沉淀，则可通过离心方式去除，如500-1000×g离心5-10 min。Q4：血清沉淀是什么？A4：用于细胞培养的胎牛血清及其他血类制品中均存在各种类型的沉淀，如纤维蛋白和磷酸钙等。一些絮状沉淀主要就是纤维蛋白，通常我们肉眼可见，大小在1-2mm之间；而磷酸钙在显微镜下观察呈现布朗运动的小黑点，通常被误认为是微生物污染。血清沉淀往往比较难以预测和控制，但幸运的是这些沉淀不会影响血清品质。Q5：血清中的小黑点是“黑胶虫”么？A5：血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫”污染的说法，但“黑胶虫”一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫”是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。Q6：如何判断血清污染？A6：（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；（2）将血清接种到血酯板上，培养后看是否有菌落形成；（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。在细胞培养时想要确定血清存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48h；真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并彻底消毒培养箱；支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。Q7：细胞形态不正常、生长状态异常或增殖速率缓慢是否与血清有关？A7：细胞形态异常需要综合关注细胞代次、传代操作、培养基和血清等诸多因素。如传代次数过多或传代时间过晚都有可能影响细胞的生长状态。有些细胞对血清具有一定适应性，更换新批次血清时可能出现所含因子水平的差异而导致的细胞生长状态受到影响的现象，可以通过血清梯度替换或者增加细胞适应时间来解决此类问题。与此同时也要关注基础培养基和传代操作等方面是否存在一定问题。Q8：如何做血清的梯度替换？A8：当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。建议的梯度替换方法为：完全培养基配置过程中先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用75%新血清与25%原血清混合培养传代；最后完全使用新血清培养传代。Q9：培养基中添加血清和抗生素后可长期保存吗?A9：新鲜培养基中添加血清和抗生素后，建议在2周内使用完。Q10：血清的热灭活是必须的吗?A10：实验表明，经热灭活处理的血清对细胞生长可能仅有微小促进或完全没有任何作用，甚至通常因高温处理而损失掉血清中部分营养成分从而影响血清质量，造成细胞生长速率降低。热灭活过程中因局部温度过高、摇晃不均匀或灭活时间过长，都会造成血清品质下降，且经热灭活后的血清会增加发生蛋白沉淀概率。因此，若非必须血清不需要做热灭活，而少数对补体敏感的细胞实验，如某些免疫学实验或腺病毒包装等，可酌情对血清进行热灭活操作。Q11：血清热灭活应如何操作？A11：1.热灭活前，必须先将解冻后的血清摇匀，并恢复至室温；2.取部分摇匀血清置于50ml离心管中，并准备同规格对照管一个；3.对照管内加入血清等体积水；4.对照管内插入温度计进行温度预试，当温度达到 56℃时将恢复至室温的血清放入水浴锅30min；5.灭活过程中需要每隔5min轻轻晃动摇匀，以保证温度均一。Q12：血清为什么存在批间差？A12：血清批间差是客观存在的，因为血清制品来源于天然活体，供体牛只的生理状况、健康状况均不同，且受饲养环境的地形、风貌、饮食、水源等影响，体内各类蛋白、生长因子和酶类的含量均有巨大差异，所以血清具有含量复杂且不固定的特性，批间差异在所难免，因此批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。

大肠杆菌（E.coli）重组蛋白表达技术经过多年的发展，相对于其他表达体系，算是非常成熟的一个体系。大肠杆菌蛋白表达系统主要有以下特点：遗传背景清楚；易于培养和控制；转化操作简单；表达水平高；成本低；周期短。本篇将对大肠杆菌重组蛋白表达系统的常见技术问题进行一一解答。1、大肠杆菌表达体系的优点是什么？（1）菌体繁殖速度快：20分钟倍增一次，这意味着按照1/100的比例接种（MOI），只需要几个小时培养基细菌即可到达稳定期；（2）容易实现高密度培养：理论培养密度是1 × 1013 cells/ml，实际培养过程中使用LB培养基在37℃培养大肠杆菌，（3）转染外源DNA容易，质粒转染效率高。2、选择什么样的质粒体系？目前最为常用的重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点（MCS）和融合蛋白移出策略(fusion tag removal strategy)。复制子：包含复制起始点及相关顺式作用控制元件（cis-acting control elements）。在选择合适的质粒载体时，质粒拷贝数应当是需要考虑的一个重要参数。几个常用的载体系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列载体含有pMB1起始子，在单个菌体中通常含有15-60 copies，通过改造pET载体，可以获得双表达质粒（BiPlasmid vector），该质粒含有双MCS位点，双T7启动子，双lac操纵子和双核糖体结合位点；pUC系列含有一个突变版本的pMB1起始子，在该系列的载体在单个细菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于双表达体系，如FRET系统，该系列含有p15A起始子，单个细胞含有10-12个copies；pSC101系列载体单个细胞中的拷贝数通常启动子：重组蛋白大肠杆菌表达体系中，lac启动子是最为常用的启动子之一。当培养基中只存在乳糖（lactose）作为wei一碳源时，lac启动子被激活，开始重组蛋白表达。常用带T7启动系统的pET系列载体表达目的蛋白，当含有T7启动系统的质粒转染进入细菌后，挑取单克隆，培养并加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一种非水解性的乳糖类似物）诱导细菌表达重组蛋白。为了消除重组蛋白本底表达，可以在原先的pET系列质粒载体基础上加入T7溶酶体与T7 RNAP（RNA polymerase）共表达，T7溶酶体能够结合T7 RNA聚合酶并限制T7启动子介导的起始转录。亲和标签：重组蛋白表达过程中采用亲和标签一方面是为了使蛋白纯化过程更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。蛋白标签可分两类：一类是短肽类标签；一类是长肽以融合蛋白（fused partner）形式共表达。长肽类标签更多的作用是促进蛋白可溶性，往往需要同时加入短肽标签以帮助蛋白纯化；短肽类标签一般只含几个氨基酸，分子量均3、去除蛋白标签的方法有哪些？去除蛋白标签的方法分为两类，一类是酶消化法；一类是化学裂解法。化学裂解法通常被用于融合伴侣蛋白的移除，如CNBr用于裂解与Met氨基酸C-端连接的多肽，该方法优点是价格便宜，缺点是蛋白序列中不能存在Met氨基酸残基。酶消化法是目前最为常用的蛋白标签去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和烟草蚀刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白标签，只残留少数几个氨基酸残基。带有His标签的TEV蛋白酶逐渐被广泛接受用于蛋白标签移除实验，该蛋白酶具有一个非常优秀的特点:切除标签后，只残留一个Ser或Gly残基或完全不残留氨基酸残基。4、什么是合适的蛋白表达宿主？重组蛋白原核表达常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作为表达宿主。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基质蛋白。同时BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突变，菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中（hsdSB突变基因来源于父辈B834菌株）。K-12系列菌株具有两大优点：一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因发生突变；另外一个是recA基因突变，改基因突变后外源质粒在宿主菌种中得以稳定存在。5、大肠杆菌表达体系为什么会出现无或低蛋白表达的结果？诱导前后蛋白存在毒性或者表达过程中密码子有偏向性，都可能造成蛋白不表达或低表达的结果。建议从以下几个方面来解决问题：1）控制本底表达水平：基于lac-based启动子表达，加入葡萄糖；选择以葡萄糖为碳源培养基；基于T7-based启动子表达，使用含有T7溶酶体质粒；使用严谨控制型质粒，降低拷贝数。2）控制诱导表达水平：采用可调节启动子；采用可控制诱导菌株；降低拷贝数；采用适用毒性蛋白表达菌株；采取分泌性表达策略。3）优化质粒DNA密码子，以适应宿主密码子体系使用密码子调整菌株。4）增加生物质：尝试新培养基；改善通气条件，避免泡沐。6、为什么会形成包涵体？重组蛋白体系表达过程中，形成不正确的二硫键、进行错误的折叠、产生低可溶性蛋白，以及缺少翻译后修饰这一重要环节，都可能形成包涵体。可以采取以下策略来解决这些问题。1）使用胞质具有氧化功能的E. coli进行分泌性表达。2）共表达分子伴侣。3）补充含有化合物伴侣和共因子的培养基。4）移除诱导剂，增加新鲜培养基。5）通过低温诱导表达或调整诱导剂浓度来降低表达速率。6）改变融合伴侣蛋白，促进可溶蛋白表达。7）改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统。

乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)是单一多肽，分子量18848u。HBcAg在HBV感染中占有重要地位，他能反映血清中：Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制，并可与其他的HBV血清学标志物起互相配合和互相补充的作用。只是由于其抗体具有很强的亲和力，能迅速地与血清中的HBcAg结合，形成免疫复合物，因而难以在血清中测得游离的HBcAg。常用ELISA和IRMA双抗体夹心法检测HBcAg。产品名称：小鼠抗乙肝核心抗原产品货号：CR2123缓冲液成分：0.01M CB、PH:9.6、N防腐剂。蛋白浓度：OD280吸光值一般为7合蛋白浓度5mg/mL，但具体以标签标识为准。制备方法：大规模细胞培养或者单抗腹水中亲和提取。特异性：不和HBsAg和HBeAg发生结合。产品纯度：以抗体计不低于90%。储存方法：请避光存放在-20℃。注意事项：虽然本产品很稳定但您还是避免过于反复融化。如果每次使用很少量可以将本抗体适度分装，每次使用一管，如需长期4℃存放请联系我们定制。另外此抗体仅用于科研不可用于诊断。有效期限：请您在管体注明有效期内使用。克隆号和使用建议：此单克隆抗体克隆号有：C0克隆，单抗为小鼠Ig3亚类，轻链为Kappa。适合标记后配合HBcAg用于竞争法检测HBcAb的研究。

Hydrogen peroxide mediates spermidine-induced autophagy to alleviate salt stress in cucumber过氧化氢介导亚精胺诱导的自噬以缓解黄瓜的盐胁迫IF: 13.3文献介绍：自噬是一种进化上保守的细胞降解过程，在植物发育和胁迫反应中起着关键作用。尽管有大量关于自噬在应对环境压力中的重要作用的信息，但对自噬的调控知之甚少。在本研究中，我们证明了亚精胺（Spd）是一种多胺，在盐胁迫下通过激活（自噬相关）基因的表达和自噬体的形成参与黄瓜耐盐性的调节。此外，NADPH氧化酶衍生的质外体HO介导的Spd诱导耐盐性和自噬。外源Spd显著提高了对盐胁迫的耐受性，抑制了不溶性蛋白质的积累和泛素化。叶面喷施Spd可促进基因转录水平和自噬体形成。此外，Spd诱导了（呼吸爆发氧化酶同系物）的表达，以及HO在叶和根中的积累。然而，用二甲基硫脲（DMTU，一种HO清除剂）或二苯基碘氯化铵（DPI，NADPH氧化酶抑制剂）预处理都可以减少Spd诱导的质外体HO的积累。重要的是，当植物被DMTU或DPI预处理时，Spd诱导的耐盐性和自噬能力受到损害。此外，沉默和减少Spd诱导的耐盐性和自噬体形成。综上所述，这些结果表明，依赖性HO介导了Spd诱导的黄瓜自噬和耐盐性Asat：光饱和共同化速率；ATG：自噬相关；DCF-DA:2，7-二氯荧光素二乙酸酯；DMTU：二甲基硫脲；DPI：二苯基碘氯化铵；DW：干重；EL：电解液泄漏；FW：鲜重；Fv/Fm：光系统II的最大量子产率；绿色荧光蛋白；MDC：单丹酰尸胺；PDS：植物素去饱和酶；PE：磷脂酰乙醇胺；PLD：磷脂酶D；RBOH：呼吸爆发氧化酶同系物；ROS：活性氧；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SIN1：盐诱导的NAC1；Spd：亚精胺；TOR：雷帕霉素的靶点；VIGS：病毒诱导的基因沉默。引用产品：Hoagland's(霍格兰氏)营养液(母液)货号：R18965产品介绍：植物组织培养技术即植物无菌培养技术，又称离体培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、花、茎尖、果实等)、组织(如形成层、表皮、表层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在细菌和适宜的人工培养基及环境条件下，能够诱导出愈伤组织、不定芽、不定根、最后形成完整菌株的技术。在配制培养基前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，当配制培养基时按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。Hoagland's(霍格兰氏)营养液(母液)主要由磷酸二氢铵、硝酸钾、硝酸钙、硫酸镁、磷酸盐等组成，其中硝酸钙工作浓度为945mg/L、硝酸钾工作浓度为607mg/L、硫酸镁工作浓度为493mg/L，使用时按比例稀释即可使用，主要用于培养植物组织，检测植物生长速率。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。操作步骤(仅供参考):1、按试剂(A)：试剂(B)：试剂(C)：试剂(D)：蒸馏水=4：4：1：1：390(共400份)的比例充分混匀，调节pH至5.5~5.9，即为改良Hoagland's营养液。4℃保存1个月有效。2、如需做半剂量(1/2剂量)或1/4剂量，将上述营养液按比例加入蒸馏水稀释即可。有效期：12个月有效；常温运输，4℃保存。

　　抗凝是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。能够阻止血液凝固的物质,称为抗凝剂或抗凝物质。检查项目不同，所用的也不同。　　实验室常用抗凝剂的选择有以下几种，实验中最常出现的几个抗凝剂。　　(一)枸橼酸盐　　主要为枸橼酸三钠，能与血液中钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。枸橼酸钠与血液的抗凝比例是1∶9或者1∶4，一般用于凝血和红细胞沉降率的检查。因其毒性小，也是输血保养液的成分之一。　　(二)肝素　　肝素是一种生理性抗凝剂，广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000，带有较多负电荷。其抗凝机制较为复杂，主要是加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并且有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。每毫升血液抗凝需要肝素(15±2.5)IU，多为肝素的钠盐或钾盐 。它不影响血细胞体积，极少产生溶血，常用于血细胞比容、血pH、血气分析及其他生化测定，是红细胞渗透脆性试验理想的抗凝剂。每管加含肝素1g/L的溶液1mL，在60℃以下烘干备用，可使5～10 mL血液不凝。肝素抗凝血不适于血涂片检查。因其在瑞氏染色时会出现背景偏蓝，不适全血液学一般检查，也不适合凝血因子的检查。　　(三)乙二胺四乙酸盐(EDTA)　　常用的有钠盐和钾盐，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而达到抗凝目的。对血细胞形态和血小板计数影响很小，适用于多项血液学检查，尤其是血小板计数，但钠盐溶解度低于钾盐，EDTA-K2最适用于全血细胞分析及血细胞比容测定，室温下6h，红细胞体积不改变。国际血液学标准化委员会(ICSH)建议血细胞计数使用EDTA-K2作为抗凝剂，用量为EDTA-K2-2H2O 1.5~2.2mg/ml血液。EDTA可抑制血小板聚集，不适用于凝血检查及血小板功能试验。　　(四)草酸盐　　常用的有草酸钠、草酸钾和草酸铵，草酸根与血液的钙离子形成草酸钙沉淀使钙离子失去凝血作用而阻止凝血。此种抗凝剂溶解度大，抗凝作用强。2mg可使1mL血不凝。因草酸盐与血液中钙离子结合生成草酸钙沉淀，可使血细胞形态发生变化，故不宜制作血涂片检查。同时草酸盐也影响血液中某些成分的生物活性，故血液学中很少应用。　　双草酸盐抗凝剂是以草酸钾和草酸铵按一定比例(通常4∶6)混合而成，适于血细胞比容测定。

　　一、缓冲液的含义　　当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液（如HOAc与NaOAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3·H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。　　二、缓冲液的种类　　1、弱酸及其盐（弱酸及其共轭碱）体系pH=pKaφ±1　　（1）醋酸－醋酸钠缓冲液　　取醋酸钠18g,加冰醋/酸9.8ml,再加水稀释至1000ml，即得。　　（2）醋酸－醋酸钠缓冲液　　取无水醋酸钠20g，加水300ml溶解后,加溴酚蓝指示液1ml及冰醋/酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml，即得。　　（3）磷酸盐缓冲液　　取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧/化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，即得。　　2、弱碱及其盐（弱碱及其共轭酸）体系pOH=pKbφ±1　　（1）氨－氯化铵缓冲液　　取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml， 再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0，即得。　　（2）氨－氯化铵缓冲液　　取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液35ml，再加水稀释至100ml，即得。

一、标准物质的定义按照《国际通用计量学基本术语》和《国际标准化组织指南30》，标准物质有如下定义：1、标准物质（Reference Material）（RM）具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。2、有证标准物质（Certified Reference Material）（CRM）采用计量学上有效程序测定的一种或多种规定特性的标准物质/标准样品(RM)，并附有证书提供规定特性值及其不确定度和计量溯源性的陈述。3、基准标准物质（Primary Reference Material）（PRM）这是一个比较新的概念。国际计量委员会（CIPM）于1993年建立了物质量咨询委员会（CCQM），在1995年的物质量咨询委员会会议上提出了如下定义：基准方法（Primary Method of Measurement）（PMM）具有最高计量品质的测量方法，它的操作可以完全的被描述和理解，其不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准标准物质：一种具有最高计量品质、用基准方法确定量值的标准物质。标准物质已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业中的“量具"，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。根据定义标准物质具有三个显著特点：1. 具有特性量值的准确性、均匀性、稳定性;2. 量值具有传递性;3. 实物形式的计量标准。其中，准确性、均匀性和稳定性是标准物质量值的特性和基本要求。下面具体分析一下：1）准确性定值准确，可靠是标准物质的主要特征，通常标准物质证书中会同时给出标准物质的标准值和计量的不确定度，不确定度的来源包括称量、仪器、均匀性、稳定性、不同实验室之间以及不同方法所产生的不确定度均需计算在内。2）均匀性材质均匀是标准物质的首要条件，计量方法的精密度即标准偏差可以用来衡量标准物质的均匀性，精密度受取样量的影响，标准物质的均匀性是对给定的取样量而言的，均匀性检验的小取样量一般都会在标准物质证书中给出。3）稳定性稳定性是指标准物质在指定的环境条件和时间内，其特性值保持在规定的范围内的能力。根据标准物质的特性，通常把标准物质分为一级标准物质和二级标准物质。1. 一级标准物质：主要用于标定比它低一级的标准物质、校准高准确度的计量仪器、研究与评定标准方法;2. 二级标准物质：主要用于满足一些一般的检测分析需求，以及社会行业的一般要求，作为工作标准物质直接使用，用于现场方法的研究和评价，用于较低要求的日常分析测量。标准物质的用途1、校准2、建立计量溯源性3、为其他材料赋值4、测量方法/程序确认5、测量质量控制6、药品检测标准物质，有助于保证药物及相关产品符合管理者和法规的质量要求。

　　酸碱缓冲溶液有三种类型：　　1、弱酸和它的盐（如：HAc---NaAc）的水溶液组成；　　2、弱碱和它的盐（如：NH3·H2O---NH4Cl）的水溶液组成；　　3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如：NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液组成。　　酸碱缓冲溶液的选型一般应根据具体情况进行选择。缓冲酸性可选用碱性缓冲液，缓冲酸性可采用碱性缓冲液。常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴bi妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。　　【酸碱缓冲溶液】由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。这种溶液称为酸碱缓冲溶液。

1．蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范围为5～100μg蛋白质，灵敏度高；但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正2．当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差

Hoechst染色方法1．贴壁细胞1)   取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。2)   刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。3)   去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。4)   加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。5)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。6)   滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。7)   荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。2. 悬浮细胞1)   离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。2)   离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。3)   最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。4)   稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。5)   均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。6)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。7)   滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。8)   H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。3. 组织切片1)   常规包埋切片后，脱蜡，透明。2)   PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。3)   加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。4)   用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。5)   将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。6)   荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

　　IgG抗体（immunoglobulin G）在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。IgG抗体持续时间长，是唯1能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。它们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿第一时间得到抗体保护。IgG是四链单体，占血清Ig总量的75%，是血清和细胞外液中最主要的抗体成分，可将人IgG分为四个亚类，依其在血清中浓度高低，分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG自出生后三个月开始合成，三到五岁接近成人水平。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，血清半衰期较长，约20~23天，是再次体液免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内广泛分布，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的主力军，故临床使用丙种球蛋白进行免疫治疗时，应以每2～3周注射一次为宜。　　IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用；IgG1、IgG2、IgG4可通过其Fc段与葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，借此可纯化抗体，或用于免疫诊断；IgG1、IgG3可高效激活补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等；某些自身抗体和引起二、三型超敏反应的抗体也属于IgG。　　IgG抗体的功能简介　　1.激活补体经典途径，介导溶菌和细胞毒作用；　　2.介导ADCC效应；　　3.调理吞噬作用；　　4.结合SPA；　　5.中和毒素和病毒。　　在抗感染免疫尤其是再次免疫应答中发挥重要作用。IgG类自身抗体参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应。　　我司所有IgG抗体产品仅供科研实验使用！

　　（1）酶原（zymogen）　　某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原(zymogen),使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogenactivation)。　　比较著名的例子是消化酶的酶原（胃蛋白酶原，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原）和血液凝固酶的酶原（凝血酶原，纤溶酶原）。酶原可以贮存在其合成部位而没有引起细胞或组织自我消化（水解）的危险，待细胞需要时再被激活。·某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原(zymogen),使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogenactivation)。　　酶原之所以没活性是因为活性中心未形成或未暴露。　　（2）酶（enzyme）　　早期是指inyeast在酵母中的意思,指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。如哺乳动物的细胞就含有几千种酶。它们或是溶解于细胞液中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上。这些酶统称胞内酶；另外，还有一些在细胞内合成后再分泌至细胞外的酶——胞外酶。酶催化化学反应的能力叫酶活力（或称酶活性）。　　酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收和利用。在胃里有胃蛋白酶，在肠里有胰脏分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等。又如食物的氧化是动物能量的来源，其氧化过程也是在一系列酶的催化下完成的。

每年1月1日，标志着新年的到来，人们习惯将这天称为“元旦”，俗称“公历年”、“阳历年”或“新历年”。2024年元旦放假安排来了！感谢您对远慕生物一直以来的支持。在您的支持和信赖下，我们才得以在激烈的市场环境下不断进步！根据国务院办公厅通知，公司对元旦放假安排如下：2024年元旦2023年12月30日（星期六）至2024年1月1日（星期一）放假 共3天。如有需要请客户及早下单备货以免耽误您的宝贵时间，在此远慕生物携全体员工祝您节日愉快，身体健康，工作顺利！

Effects of tannic acid on the immunity and intestinal health of broiler chickens with necrotic enteritis infectionIF: 7文献引用产品：鸡分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA试剂盒品牌：远慕生物货号：YM-A3724AbstractBackground In broiler chickens, necrotic enteritis (NE) infection can reduce production performance. Tannic acid has shown great potential as a treatment of NE in broilers. However, the appropriate dosage of tannic acid in NE of broilers and the improvement effect on intestinal health are not very clear. In this study, we aimed to investigate the effects of different doses of tannic acid on the production performance, immunity, and intestinal health of broilers by constructing an NE model with C. perfringens infection and determining the appropriate dosage of tannic acid with regard to NE.Results Challenged birds showed significant reduction in body weight, villus height, and the ratio of villus height to crypt depth (P Conclusions Tannic acid in the diet alleviated NE by enhancing the intestinal barrier and absorption function. The recommended dietary tannic acid additive level is 500–750 mg/kg. Our study findings would be useful in reducing related economic losses in the broiler industry.Keywords Broiler chicken, Immunity, Intestinal health, Necrotic enteritis, Tannic acid

一. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？一般来说，如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话，如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法：1.一般用APES：丙酮=1:50的处理液来处理片子，处理5min左右，然后水洗，烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上，水比较聚的话说明片子处理的好。2.贴片子的时候，展片的时间要把握好，不要太长，否则不利于贴牢。3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要马上收起来，而是水平至于烘片台上37度两个小时以上，一是水分彻底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。4.再补充一点 ，石蜡包埋时，酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分，这对贴片也有影响。如果这些导致掉片的因素都已经排除但是片子还是掉的厉害，那么也可能是以下原因造成的：1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3、组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4、没烤好，时间短温度不够之类。5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。6、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。二. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：1.切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。2.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。3.如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。三. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体 试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。全片着色：全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会 游离出 氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到 理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组 化染 色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太 长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。四. 免疫组化结果老是出现阴性结果？免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。五. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。六. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果 来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加 热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖 上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调ph值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。七. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的，一是因为石蜡切片比较薄，另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏，所以这一步可以省略。八. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？复染时间不需要太长，当然这也要根据苏木精的质量来确定，但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量浓盐酸）分色，分色的另 外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合，这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度，分色这一步最好不要省掉。分色后记得再 用氨水返蓝一下。